Эффективность индукции процессинга тДНК церез 48 часов инкубации агробактерий с тканями растений. Титр жизнеспособных бактерий после инкубации с эксцудатами растений проверяли путем их высева в различных разведениях на чашки Петри с агаризованной средой LB. Каждый вариант опытов проводили в трех повторностях.

2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens

ДНК выделяли по модифицированному методу Draper с соавт.Через 48 часов совместного культивирования агробактерий с тканями растений из пробирок удаляли растительную ткань, бактерии собирали, центруфугировали при 9000 g. Осадок, полученый из 10 мл инкубационной среды лизировали в течение 45 мин при 370 С в 500 мкл ТЕ буфера (10 мМ трисHCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА), содержащего 1% сарколизата Na и 1,5 мг/мл проназы. Лизат дважды экстрагировали фенолом и дважды хлороформом. ДНК осаждали спиртом и растворяли в ТЕ–буфере.

2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну

В целях дополнительной проверки наличия индукции процессинга и присутствия в пробах pBR322 татальную ДНК агробактерий в количестве 5 мкг наносили в лунки 0,8% агарозного геля и проводили электрофорез при 25–100 В в течение 2 часов в буфере, содержащем: 40 мМ трис–ацетат (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА и 5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве маркеров молекулярного веса использовали ДНК фага l, гидролизованную рестриктазной эндонуклеазой Hind III. Блод–гибридизацию проводили на ––––– фильтрах. В качестве зонда использвали ДНК плазмиды pBR322, меченную 32 –– с помощью ДНК–полимеразной системы.

2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli

Штаммы E. сoli HB101 выращивали в жидкой среде LB при 370 С до концентрации 5*107 клеток/мл (А600 = 0,45). Для количественного изучения процессинга тДНК использовали комплементарные клетки бесплазмидного штамма E. сoli HB101, которые трансформировали тотальной ДНК агробактерий, которая была выделена (М-2), претерпевших различную переработку. Трансформанты каждого варианта высевали на три чашки Петри с агаризированной средой LB, содержащей ампицилин (50 мкг/мл). Количество колоний подсчитывали. В контрольных экспериментах клетки трансформировали плазмидой pBR322, и другой контроль не был подвергнут трансформации и колоний обнаружено не было.

3. результаты

Для обнаружения процессинга агробактериальной тДНК, индуцированного экссудатами анализированных растений, в работе применяли метод "спасения плазмиды", предложенный Koukolikova-Nikola с соавт. Этот метод основан на использовании модифицированной Ti-плазмиды pGV385 [11], содержащей между правой и левой границами значительно делетированной исходной тДНК бактериальной плазмиды вектор pBR322. Таким образом, индуцирование процессинга тДНК в модифицированной Ti-плазмиде pGV3850 можно прослеживать по вырезанию из нее низкомолекулярного фрагмента ДНК, в состав которого входит плазмида pBR322. Этот процесс можно тестировать различными методами. Один из них – это трансформация клеток E. сoli тотальной агробактериальной ДНК и отбор трансформантов по селективным маркерным признакам плазмиды pBR322 – устойчивой к антибиотикам. Другим методом может быть блод-гибридизация – анализ тДНК с помощью плазмиды pBR322 в качестве гибридизационного зонда. Оба этих метода были использованы в настоящей работе. Сравнили эффективность индукции процессинга экссудатами различных растений проведено по отношению к активности 100 мкМ ацетосирингона. Известно, что это токсифенольное соединение, выделяемое некоторыми двудольными растениями, принадлежит к сигнальным молекулам, индуцирующим вырезание и перенос агробактериальной тДНК.

Результаты трансформации клеток E. сoli НВ101 тДНК подвергнутых воздействию экссудатов листьев различных растений представлены в таблице.

Таблица 3.1.

Экссудаты листьев ряски индуцировали вырезание тДНК, что является доказательством присутствия в их составе сигнальных соединений, специфических для индукции транскрипции генов vir агробактериальной Ti-плазмиды.

Прямой блод-гибридизационный анализ тДНК агробактерий свидетельствует о присутствии у ряски сигнальных молекул, индуцирующих образование тДНК [12].

4. обсуждение

Использованный подход позволяет регистрировать присутствие сигнальных молекул в экссудатах различных тканей растений по одному из важнейших результатов индукции генов области vir, а именно по вырезанию тДНК из агробактериальной Ti-плазмиды. В настоящей работе мы применили два метода детекции процессинга тДНК модифицированной агробактериальной Ti-плазмиды. PGV3850 [11].

Полученные результаты позволяют расширить список однодольных растений (на одно растение), синтезирующих сигнальные молекулы, индуцирующие процессинг агробактериальной тДНК. Примененный метод "спасения плазмиды" позволяет выявлять появление циклических форм модифицированной тДНК pBR322 и ее линейных форм [20].

Рассмотренный в работе метод позволяет учитывать присутствие в экссудатах растений веществ с бактериостатической активностью. Вещества такой природы могут существенно влиять на эффективность трансформации растений агробактериями.

Мы не анализировали химическую природу сигнальных молекул ряски. Не исключено, что сигнальные молекулы могут отличаться от сигнальных фенольных соединений двудольных растений. Специфический процесс взаимодействия между агробактериями и покрытосеменными растениями существовал, по-видимому, еще до их дивергенции на двудольные и однодольные [15].

Штаммы агробактерий обладают многими особенностями и именно рецепторы (продукты гена vir A), различающиеся по способности узнавать сигнальные молекулы различной природы.

Следует отметить, что растительные вещества с сигнальной функцией для агробактерий не является уникальным примером существования соединений, выполняющих эту важную роль во взаимодействии микроорганизмов с растенями [22].

Молекулярные сигналы растений играют важную роль в установлении паразитических и симбиотических взаимоотношений между бактериями и растениями, определяя при этом круг растений для определенного микроорганизма. Всесторонние структурно-функциональные исследования специфических молекулярных сигналов во взаимодействии между микроорганизмами и растениями должны ответить на многочисленные вопросы о молекулярно-генетических механизмах этих взаимоотношений и способствовать развитию эффективных методов генетической инженерии важнейших сельскохозяйственных и экологически-индикаторных культурах растений (как ряска).

Список литературы