Рассчитали концентрацию пигментов, полученные данные занесли в таблицу 2.

Таблица 2 Концентрация пигментов в вытяжке

Вычислили содержание пигментов в вытяжке, тут же посчитали их содержание с учетом объема, массы пробы и разведения.

Fа = 9*20/1000*1 = 0,18г/г

Fв = 67,4*20/1000*1 = 1,35 мг/г

Fкар = -17*20/1000*1 = -0,34 мг/г

Нанесение пигментов на бумагу

Для разделения пигментов используют лист бумаги размером 16х16 см.

При одномерной хроматографии 1 мл полученной вытяжки наносят полосой длиной 12 см на расстоянии 2 см от нижнего края листа. Нанесли 1,4 мл образца.

Разделение пигментов на одномерной хроматограмме

На одномерной хроматограмме в зависимости от применяемой для разгонки смеси растворителей удается отделить каротин, ксантофиллы и хлорофилл а и в.

Хроматограмму помещают в камеру, заполненную 30 мл смеси, состоящей из бензола и петролейного эфира (2:1). Через 30-40 минут, когда фронт растворителя поднимется на 14 см и будет видно четкое разделение пигментов, хроматограмму вынимают и подсушивают. Самую верхнюю полосу образует каротин, ниже него лежит хлорофилл а, под ним распологаются ксантофиллы, а самый последний – хлорофилл в.

Окрашенные полосы, соответствующие пигментам вырезают, измельчают и переносят в отдельные бюксы на 25 мл. Каротин эллюируется хлороформом, ксантофиллы и хлорофиллы – смесью спирта с ацетоном (1:3).

Растворитель добавляют небольшими порциями, каждый раз настаивая 2-3 минуты.

Эллюция пигментов с бумажного носителя

Эллюцию проводят до полного обесцвечивания бумаги. Элюат фильтруется через стеклянный фильтр или центрифугируется для удаления взвешенных частиц бумаги. Экстракт аккуратно сливают в мерные пробирки и доводят до 5-10 мл в зависимости от интенсивности окрашивания. Полученные экстракты используют для фотоколориметрии с использованием калибровочной кривой, построенной для определенного прибора.

Для получения калибровочных кривых использовали два раствора – раствор Гетри (для зеленых пигментов) и двухромовокислый калий (для желтых пигментов).

Определение оптической плотности пигментов

Оптическую плотность элюата определяют на фотоэлектроколориметре, за синим светофильтром для желтых пигментов и красным для зеленых. Желательно работать в средней области шкалы, где относительная ошибка прибора минимальна.

Оптическая плотность элюата

Перед тем, как рассчитать содержание пигментов, была построена калибровочная кривая. Использовали раствор известной концентрации 1% CuSO4*5H2O – 25,5 мл; 2%К2Сr2O7 – 50 мл; 7% - NН4ОН (100мл раствора).

Желтые пигменты

Зеленые пигменты

После измерения оптической плотности был построен калибровочный график.

Эквиваленты:

Хлорофилл а – 23,3 мг

Хлорофилл в – 31,5 мг

Каротин – 2,35мг

Виолоксантин – 2,7 мг

По калибровочному графику с помощью оптической плотности элюата нашли концентрации хлорофиллов и каротиноидов. (рис1)

Затем рассчитали содержание пигментов по формуле

Х= (С1*Vэл*Vэк)Vн*Р,

где С1- концентрация пигмента в элюате, определенная по калибровочному графику согласно оптической плотности;

Vэл – объем элюта, мл; Vэк – объем экстракта из навески, мл; Vн – объем раствора, нанесенного на бумагу, мл; Р – навеска в г.

Ха = (4,5мг/л*5мл*20мл)/2мл*1г=225мг/л

Хв = (1мг/л*5мл*20мл)/2мл*1г=50мг/л

Хкар = (1,2мг/л*5мл*20мл)/2мл*1г=60мг/л

Чтобы сравнить получившиеся данные по двум способам расчета пигментов, необходимо привести к одним единицам измерения.

Ха =225мг/л/1000 = 0,225 мг/г

Хв = 50мг/л/1000 = 0,05 мг/г

Хкар = 60мг/л/1000 = 0,06 м/г

Рис1. Калибровочная кривая для зеленых пигментов (ряд1 – хлорофилл а, ряд 2 – хлорофилл в)

Рис2. Калибровочная кривая для жлтых пигментов (ряд1 – каротиноиды, ряд2 – виолоксантин)