Повышение уровня цАМФ в нервных клетках, вызванное действием факторов, непосредственно влияющих на аденилатциклазную систему, сопровождается более чем 10-кратным увеличением концентрации 2–5А. Установлено, что рост уровня олиго синтетазы и концентрации 2–5А наблюдается при дифференцировке клеток и замедлении клеточного деления.

Исследование биологических свойств 2–5А показало, что этот олигоиуклеид способен обратимо активировать специфическую латентную нуклеазу, ускорять гидролиз РНК и, таким образом, ингибировать синтез белка in vivo и тормозить процесс размножения клеток. Следовательно, повышение уровня 2–5А и изменение концентрации цАМФ является частью универсального механизма регуляции клеточного деления. К настоящему времени установлены два взаимодополняющих процесса, с помощью которых осуществляются эти регуляторные реакции. С одной стороны, стимуляция А-киназы при повышении уровня цАМФ приводит к фосфорилированию белка сМг – 18 кД. Этот белок в виде фосфоформы является ингибитором активности 2' – фосфодиэстеразы – фермента гидролиза 2–5А. С другой стороны, повышение концентрации цАМФ внутри клетки вызывает индукцию олиго синтетазы. осуществляющей синтез 2–5А.

Совокупность этих событий приводит к устойчивому повышению уровня 2–5А и связанному с этим переходу нервных клеток в состояние покоя. По-видимому, именно таким образом осуществляется ярко выраженный антинролиферативный эффект цАМФ, вызванный действием этого вторичного посредника на систему метаболизма 2–5А. При этом взаимное влияние уровней цАМФ и 2–5А основано на механизме отрицательной обратной связи. Так, установлено, что подъем уровня 2–5А, обусловленный увеличением внутриклеточной концентрации цАМФ по указанным механизмам, в свою очередь, способствует активации фосфодиэстеразы цАМФ. В результате происходит снижение уровня цАМФ и прекращение роста концентрации 2–5А, который является в этом случае вторичным посредником в проявлении антипролифера-тивного действия цАМФ.

1.3 Фосфодиэстераза

В прекращении сигнала цАМФ участвуют фосфодиэстераза, гидролизующая этот нуклеотид до АМФ. В противоположность аденилатциклазе фосфодиэстераза – преимущественно растворимый фермент. В то же время активность фермента обнаружена во фракциях саркоплазматического ретикулума, митохондрий и ядер.

Циклонуклеотидактивируемая фосфодиэстераза гидролизует как цАМФ, так и цГМФ, при этом под действием цГМФ ускоряется гидролиз цАМФ и наоборот, что свидетельствует о положительной кооперативности двух активных центров. Несомненна роль фермента в проведении нервного импульса: так, в постсинаптической мембране нервной ткани обнаружен необычайно высокий уровень фосфодиэстеразы цГМФ.

Для фосфодиэстеразы характерно наличие множественных форм. Эти формы различаются как по молекулярной массе, так и по сродству к одному и тому же и к различным циклическим нуклеотидам. В целом, сродство к циклическим нуклеотидам у фосфодиэстераз в 100–1000 раз ниже, чем у протеинкиназ А и G, поэтому при ускорении синтеза нуклеотидов сначала происходит насыщение циклическими нуклеотидами регуляторных центров киназ и лишь затем – гидролиз цАМФ и цГМФ фосфодиэстеразами.

В мозге содержатся Са-кальмодулинрегулируемые формы как цАМФ-синтезирующего, так и цАМФ-гидролизующего ферментов. Са-кальмодулинзависимая фосфодиэстераза представляет собой гомодимер, состоящий из субъединиц с различной молекулярной массой у разных изоформ фермента. Ограниченный протеолиз субъединицы 60 кД приводит к появлению фрагмента с Мг = 36 кД и необратимой активации фосфодиэстеразы. Фрагмент 36 кД более не активируется кальмодулином. Следовательно, субъединицы фосфодиэстеразы включают 2 фрагмента: каталитический и регуляторный.

Анализ регуляторных свойств фосфодиэстеразы в нервной ткани свидетельствует о тесном сопряжении между цАМФ- и Са-зависимыми системами внутриклеточной сигнализации; это сопряжение может модулироваться с помощью изоферментов фосфодиэстеразы. Так, в мозге быка найдены 2 изоформы Са-КМ-зависимой фосфодиэстеразы, состоящей из субъединиц с Мг = 60 и 63 кД. Изофермент с субъединицами 60 кД может быть фосфорилирован цАМФ-зависимой протеинкиназой, что приводит к уменьшению сродства фосфодиэстеразы к кальмодулину. Дефосфорилирование этого изофермента осуществляет Са-КМ-стимулируемая протеинфосфатаза; при этом восстанавливается чувствительность фосфодиэстеразы к кальмодулину.

В отличие от изофермента с субъединицами 60 кД фосфорилирование изоформы фосфодиэстеразы с субъединицами 63 кД осуществляется Са-КМ-зависимыми протеинкиназами. Это фосфорилирование также приводит к потере чувствительности фосфодиэстеразы к кальмодулину и "обращается" Са-КМ-стимулируемой протеинфосфатазой с восстановлением чувствительности фосфодиэстеразы к КМ. Очевидно, такой механизм регуляции фосфодиэстеразы реализуется в мозге in vivo, несмотря на очень высокую, "насыщающую" концентрацию в нем КМ. Фосфорирование снижает сродство фермента к КМ и обусловливает зависимость его активности от физиологических концентраций Са+.

В нервной ткани, таким образом, существует тесная взаимосвязь между двумя системами вторичных посредников, Са+ и цАМФ, осуществляемая посредством цАМФ- и Са-зависимого фосфорилирования-дефосфорилирования различных изоферментов фосфодиэстеразы цАМФ. Эта взаимосвязь может модулироваться также различным сродством к Са+ аденилатциклазы, фосфодиэстеразы, протеинкиназы и фосфатазы. Так, аденилатциклаза мозга активируется гораздо более низкими концентрациями Са чем фосфодиэстераза.

Кроме циклических нуклеотидов, Са+ и ограниченного протеолиза фосфодиэстеразу активируют также полианионы, фосфолипиды, жирные кислоты. Ингибиторами или активаторами фермента являются многочисленные фармакологические вещества. Фосфодиэстераза является более "удобной" мишенью для действия лекарственных препаратов, чем аденилатциклаза, так как менее специфична в отношении эффекторных влияний. Мощными ингибиторами фосфодиэстеразы являются производные ксантинов – ингибирование осуществляется блокадой аллостерического центра связывание нуклеотидов.

2. цГМФ-зависимое протеинфосфорилирование

Вскоре после открытия цАМФ-зависимых протенкиназ был обнаружен еще один класс циклонуклеотидзависимых фосфорилирующих ферментов, стимулируемых с помощью цГМФ, – протеинкиназы G. В тканях млекопитающих содержание протеинкиназ G весьма невелико. Наиболее высок уровень активности и содержания протеинкиназ G в мозжечке, сердечной мышце и легких, эти же ткани содержат и наибольшее количество цГМФ, не превышающее, впрочем, 10% от содержания в них цАМФ. Основное количество протеинкиназы G обнаружено в цитозоле, некоторая часть фермента связана с цитоплазматическими мембранами и ядерной фракцией.

Фермент состоит из двух примерно идентичных субъединиц, каждая из которых имеет каталитическую активность и способна связывать циклический нуклеотид. Ограниченным протеолизом можно перевести димер в мономеры и затем разделить каждую субъединицу на цГМФ-связывающий и каталитический фрагменты. Эти исследования наряду с выявленной гомологией между протеинкиназой G и протеинкиназой А II типа по субстратной специфичности, аминокислотной последовательности, способности к аутофосфорилированию, иммунологическим свойствам привели к представлению о том, что цАМФ и цГМФ-зависимые протеинкиназы эволюционировали от общего гена, кодирующего одну полипептидную цепь. В процессе развития цАМФ-зависимый фермент стал синтезироваться в виде разобщенных компонентов, тогда как цГМФ-зависимая протеинкиназа синтезируется как одна цепь.