Пептидазы. В первой группе протеолитических ферментов – пептидазах – подразделение по подподклассам осуществляется на основе механизма расщепления пептидных связей в пептидах. К группе ферментов, входящих в 11-й подподкласс (КФ 3.4.11) – α-аминоацилпептидгидролазы – относятся те, которые гидролитически расщепляют первую с N-конца пептидную связь. Группа КФ 3.4.12 – гидролазы пептидиламинокислот или гидролазы ациламинокислот – объединяет ферменты, действующие на первую пептидную связь с С-конца. Ферменты группы КФ 3.4.13 – дипептидгидролазы – гидролизуют дипептиды; групп КФ 3.4.14 – дипептидилпептид гидролазы – и КФ 3.4.15 – пептидилдипептидгидролазы – гидролизуют дипептиды соответственно с N- и С-конца. С 16-го до 20-го подподкласса в номенклатуре сделан пропуск с учетом будущих открытий ферментов, гидролизующих дипептиды.

Протеиназы. Вторая группа протеолитических ферментов – протеиназы – имеет четыре подподкласса (21 – 24), в котором все ферменты подразделяются в зависимости от особенностей механизма катализа, установленного по функционированию активного центра фермента, а также влияния рН на его активность. Специфичность к субстрату рассматривается лишь с позиции идентификации индивидуальных ферментов в пределах каждой из групп.

Сериновые протеиназы. К подподклассу 3.4.21 относятся протеиназы, для которых характерно наличие в каталитическом центре триады аминокислот: аспарагиновая кислота, гистидин и серии. В этот подподкласс внесены многие хорошо изученные протеийазы животного происхождения (химотрипсин, трипсин, тромбин, плазмин, эластаза и др.) и некоторые микробные протеиназы.

Тиоловые протеиназы. К подподклассу 3.4.22 относятся протеиназы, имеющие в активном центре SH-группу цистеина.

В подподкласс 3.4.22 вошел ряд важных протеиназ растительного происхождения, такие как папаин, фицин, бромелаин, химопапаин, и некоторые микробные протеиназы.

Кислые протеиназы. Они входят в подподкласс (3.4.23) и имеют оптимальный рН ниже 5, в каталитическом акте у этих ферментов участвуют остатки дикарбоновых аминокислот. Наиболее широко известны из этого подподкласса пепсин, катепсин и ряд кислых протеиназ грибного происхождения. В последний под подкласс (3.4.24) входят протеиназы, содержащие ионы металлов. В основном это различные микробные нейтральные протеиназы и некоторые протеиназы животного происхождения.

В классификации и номенклатуре протеолитических ферментов выделена ещё одна, третья группа протеиназ, которые включены в подподкласс 3.4.99. Это протеиназы с неизвестным механизмом катализа. В этот подподкласс внесено 26 ферментов, среди них много микробных протеиназ, но есть протеиназы и животного происхождения. Создание подподкласса 3.4.99 вызвано тем, что многие протеиназы обладают близкой, но не полностью изученной и определенной специфичностью. Они действуют на один и тот же субстрат, однако продукты гидролиза отличаются не только количественно, но и качественно.

Отличительной особенностью многих протеолитических ферментов животного происхождения является то, что они в организме существуют в неактивном состоянии в виде зимогенов, которые только при определенных условиях могут превращаться в активные формы. Это трипсин, химотрипсин, карбоксипептидазы, А и В, пепсины, реннин, катепсины, аминопептидазы, дипептидазы, тромбин, плазмин и др. Многие из данных ферментов получены в кристаллическом виде. Они чаще используются в медицине. Механизм их действия, субстратная специфичность, механизм ингибирования и активации подробно изучены. Имеются данные о строении активного центра, а для некоторых протеиназ известна и структура самого фермента. Также глубоко и всесторонне изучены основные протеиназы растительного происхождения: папаин, фицин, бромелаин, химопапаин, которые за рубежом широко применяются в медицине и пищевой технологии.

2.3 Получение микробных протеиназ

В Номенклатуру и классификацию ферментов внесено большое количество протеолитических ферментов микробного происхождения, которые относятся к различным подподклассам: 3.4.11 (7 ферментов), 3.4.13(5), 3.4.15(1), 3.4.16(1), 3.4.17(5), 3.4.21(4), 3.4.22(3), 3.4.23(1), 3.4.24(4) и 3.4.99(4). Необходимо отметить, что часто под одним номером находится очень много ферментов, получаемых из различных источников, но имеющих сходные свойства. Так, в подподклассе 3.4.21.14 представлена целая серия микробных протеиназ, среди продуцентов которых отмечаются Bacillus subtilis, E. coli, щелочная протеиназа из культур рода Aspergillus, Tritirachium album, Arthrobacter, Pseudomonas aeruginosa, Malbranchea pulchella, Streptomycer rectus, Candida lipolytica и др. Под номером 3.4.23.6 также объединено много ферментов, источниками которых являются микроорганизмы, в основном относящиеся к грибам родов: A. oryzae, A. terricola, A. saitoi, A. niger, P. janthinellum, R. chinensis, M. pusillus, M. miehei, Endothia parasitica, Candida albicans, Saccharomyces carlsbergensis, Rhodotorula glutinis, Physarum polycephalum и др. Все микробные металлопротеиназы объединены под номером 3.4.24.4. Они выделены из культур родов: Streptomyces, Sarcina, Micrococcus, Staphylococcus, Bacillus, Aeromonas, Pseudomonas, Escherichia, Aspergillus, Myxobacter, Serratia.

Однако в промышленности чаще всего получают комплекс протеолитических ферментов, достоинства которого определяются с учетом последующего применения ферментного препарата. Суммарная протеолитическая активность такого препарата определяется на соответствующем субстрате: гемоглобине, желатине, растительном белке, эластине, коллагене и т. д.

2.3.1 Технологические схемы производства микробных протеиназ

Технологические схемы производства микробных протеиназ (см. рис. 1 и 5) отличаются друг от друга прежде всего на первой стадии получения микробной культуры продуцента, на стадиях выделения различия меньше.

2.3.2 Продуценты

В качестве продуцентов протеолитических ферментов при глубинном культивировании в промышленных условиях используют бактерии в основном рода Bacillus, реже – актиномицеты и микроскопические грибы. Способность к образованию протеолитических ферментов отмечается практически у всех известных микроорганизмов, так как роль этих ферментов в регуляции жизненных функций организмов очень велика. Протеолитические ферменты в подавляющем большинстве случаев являются внеклеточными.

2.3.3 Регуляция синтеза протеиназ

В самом общем виде гипотетический механизм регуляции биосинтеза внеклеточных протеаз у микроорганизмов представлен на рисунке 14. Авторы этой модели, основываясь на данных литературы и собственных исследованиях, предполагают, что иРНК-экзопротеазосинтезирующая система безуспешно конкурирует с системами других РНК вследствие низкого сродства специфических факторов инициации или РНК-полимеразы с участком инициации на экзобелковом гене. Известно, что синтез РНК контролируется либо соотношением ненагруженных и аминоацилированных тРНК (при этом свободные тРНК являются репрессорами синтеза), либо действием гуанозинтетрафосфата (ppGpp), который образуется при аминокислотном голодании и подавляет биосинтез РНК. Суть предлагаемой модели заключается в следующем. Присутствие в среде в достаточном количестве всех необходимых аминокислот и других источников углерода, азота и серы позволяет поддерживать внутриклеточный пул микроорганизма на высоком уровне. При этих условиях клетка осуществляет интенсивный синтез нетранслируемых РНК и иРНК для внутриклеточных белков. В результате содержание свободных факторов инициации РНК-полимеразы, которые могут принять участие в синтезе иРНК экзопротеаз, незначительно. Вероятно, этим объясняется низкая частота транскрипции иРНК экзопротеаз и, следовательно, низкий уровень образования внеклеточных протеаз, например, в начале роста культуры на такой сбалансированной среде (левая сторона схемы).