Растения, полученные из протопластов, могут отличаться достаточно выраженной изменчивостью по ряду интересующих нас признаков: урожайности, величине (размеру), морфологии отдельных частей, фотопериодичности и др. Как правило, это связывают с изменением числа и перестройками хромосом. Поэтому протопласты растений представляют собой интересные объекты и для изучения процессов мутагенеза.

Гибридизация протопластов удается не только в тех случаях, когда исходные растения (источники клеток для протопластирования) способны гибридизоваться половым путем, но и тогда, когда заведомо известно, что клетки, подлежащие слиянию, относятся к организмам с половой несовместимостью. Тем не менее, во всех случаях соматической гибридизации один из партнеров должен нести какой-либо маркерный признак (биохимический или другой), по которому возможно подтвердить достоверность получения гибрида. В этом смысле удобны ауксотрофные мутанты.

Гетерокариотические соматические гибриды выделяют либо вручную с помощью микроманипулятора, капиллярной пипетки и шприца, либо автоматически на основе применения флуоресцентных систем.

Для биотехнологии также важна цибридизация, когда возникают гетерозиготы по внеядерным (цитоплазматическим) генам, определяющим, например, устойчивость к гербицидам или признак цитоплазматической мужской стерильности (рисунок).

К настоящему времени из ряда растительных протопластов получены их безъядерные фрагменты – микропласты,окруженные тонопластной мембраной и включающие часть внеядерного генетического материала. Используя приемы соматической гибридизации, микропласты можно сливать с реципиентными протопластами. [1]

Таким образом, микропласты являются резервным материалом для расширения возможностей клеточной инженерии в фитобиотехнологии. Более того, теперь удается гибридизация растительных протопластов с протопластами микроорганизмов и животными клетками.

Применительно к хромосомной инженерии удалось доказать проникновение изолированных метафазных хромосом в обработанные полиэтиленгликолем реципиентные протопласты таких однодольных растений, как пшеница и кукуруза.

Также открываются пути привнесения дополнительной генетической информации по желанию экспериментатора в целях создания трансгенных растений. Прямой перенос чужеродной ДНК в протопласты возможен также с помощью микроинъекции, трансформации, упаковки в липосомы с последующим их эндоцитозом растительными протопластами, и электропорации (высоковольтных электрических импульсов).

3. Перенос чужеродной ДНК в протопласты Проблема создания векторов для введения чужеродной ДНК в протопласты растений является наиболее сложной. Здесь наметились следующие подходы:1) использование плазмид бактерий, заражающих растения в естественных условиях; при этом часть плазмиды встраивается в ядерный геном растения-хозяина и функционирует в составе его генома;2) использование бактериальных плазмид, «сшитых» с фрагментами ДНК хлоропластов или митохондрий растений, для создания челночных векторов, способных к репликации в клетках прокариот и экспрессии в эукариотических клетках;3) использование ДНК-содержащих вирусов растений; в такой системе ДНК функционирует автономно от генома растения-хозяина.

Для переноса чужеродной ДНК в растения наиболее широко используется агробактериальная трансформация с помощью бинарных плазмидных векторов.

Практикуются также методы переноса генов в растения путем электропорации, трансформации растительных протопластов чужеродной ДНК в присутствии полиэтиленгликоля, микроинъекцией ДНК, биологической бомбардировкой золотыми или вольфрамовыми частицами, покрытыми молекулами ДНК, введением плазмидной ДНК с помощью игольчатых кристаллов карбида или нитрида кремния и др.

Но все эти способы получения трансгенных растений так или иначе основаны на использовании селективных маркерных генов, которыми обычно служат бактериальные гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам.

Иными словами, тот фрагмент ДНК, который исследователь вводит в геном трансформируемого растения, помимо нужного гена, содержит и маркерный ген.

Эти селективные маркерные гены нужны для того, чтобы в лаборатории в процессе регенерации отделить единичные трансформированные клетки от нетрансформированных (которых большинство) и дать первым преимущество при делении.

В результате трансгенное растение, полученное из таких трансформированных клеток, становится устойчивым к определенному антибиотику (чаще всего к канамицину) или к какому-нибудь гербициду вроде глифосата. При последующем выращивании трансгенных растений в полевых условиях появляется теоретическая возможность перемещения генов резистентности к гербициду в родственные сорняки или генов резистентности к антибиотику назад в бактерии почвы. Именно здесь и заключается определенная экологическая опасность ввиду вероятности появления, в частности, так называемых суперсорняков.

Однако в целом ряде работ было показано, что такое событие крайне маловероятно. Более того, выращивание так называемых транспластомных растений (на которых остановимся чуть ниже) сводит часть этих опасений к нулю, ввиду того, что пыльца у таких растений остается не трансгенной. [8]

К тому же процессы переноса генов, хотя и с чрезвычайно низкой частотой, но происходят в самой природе с помощью бактерии Agrobacterium tumefaciens, которую даже называют «природным генным инженером», и поэтому такие измененные самой Природой растения нас уже давно окружают.

4. Повышение стабильности протопластов

Наиболее остро стоит вопрос о получении растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства (прежде всего к фитопатогенным грибам и насекомым), так как болезни растений стали основным лимитирующим фактором получения урожая.

Было обнаружено, что устойчивость растений к вредителям можно запрограммировать генетически – введением в геном растений чужеродных генов, продукты которых вызывают гибель вредителя. Традиционно для этого используют ген bt, продуктом которого является бактериальный токсин, продуцируемый бактерией Bacillus thuringiensis. Этот крупный белок (протоксин), контролируемый геном bt, попадая в кишечник личинок насекомых, разрушается под действием ферментов, а его фрагмент (эндотоксин) приводит к гибели насекомых. Трансгенные растения картофеля, хлопка, кукурузы с геном bt уже производятся фирмами «Monsanto», «Ciba Seeds» и успешно продаются на мировом рынке.

Известно, что растения, подобно животным, способны вырабатывать иммунитет. Однако этим замечательным свойством обладают только устойчивые растения, у которых при атаке патогенов резко меняется метаболизм. В результате у этих растений накапливаются такие химические соединения, как пероксид водорода), салициловая кислота и фитоалексины. Повышенное содержание этих соединений способствует противостоянию растения в борьбе с патогенами.

Например, трансгенные растения табака, которые содержат бактериальный ген, контролирующий синтез салицилата гидролазы (этот фермент разрушает салициловую кислоту), были неспособны к иммунному ответу. Поэтому изменение генно-инженерным путем уровня салициловой кислоты или выработки и растениях в ответ на патоген пероксида водорода может быть перспективным для создания устойчивых трансгенных растений.