Прогормонконвертазы

К семейству прогормонконвертаз (фуриновых эндопептидаз) в настоящее время относят ряд субтилизиновых эндопептидаз, локализованных в секреторных везикулах различных тканей. Эти ферменты расщепляют различные пропептиды по парам основных аминокислот . Они имеют сходные физико-химические, каталитические и иммунологические свойства, но отличаются по значениям молекулярной массы, связанными с отличиями в строении С-концевого домена . Они проявляют максимальную активность при pH,-,, активируются ионами Ca+, ингибируются ЭДТА .

В тканевом, региональном и клеточном распределении различных ферментов данного семейства обнаружены существенные отличия. Так, фурин широко распространён во всех тканях организма, тогда как PC/ и PC локализованы, в основном, в эндокринных и нейроэндокринных клетках, а PC обнаружена в семенниках . В нейрональных клетках, осуществляющих процессинг ПОМК, экспрессируется PC, но не PC/ .

В субстратной специфичности указанных ферментов также обнаружены некоторые отличия. Так, PC расщепляет хроматогранин A, а PC/ – нет, PC/ расщепляет проинсулин преимущественно при Arg-Apr, а PC – при Lys-Arg .

В настоящее время не вызывает сомнений, что прогормонконвертазы вовлекаются в процессинг предшественников биологически активных пептидов и секретируемых белков . Эти ферменты не являются пептид-специфичными, но отличия в их субстратной специфичности могут способствовать образованию различных продуктов из одних и тех же предшественников в разных тканях .

Са+ - зависимая нейтральная протеиназа

Ca+-активируемая нейтральная протеиназа (CANP, кальпаин, Ca+-зависимая нейтральная протеиназа, (К.Ф )) впервые обнаружена в головном мозге крысы Guroff . Фермент выделен и очищен из головного и спинного мозга, а также других тканей различных видов животных.

CANP из различных источников имеет оптимум pH при pH,-, с максимумом при pH,-,, он является метал-зависимой тиоловой протеиназой и требует для проявления активности присутствия восстанавливающих реагентов. Фермент ингибируется хелатирующими агентами; N-этилмалеимидом, ПХМБ, ПХМФС, иодуксусной кислотой; ингибиторами тиоловых протеиназ лейпептином, антипаином и мерсалилом; N,a-тозил-L-лизин хлорметилкетоном; додецилсульфатом натрия; мочевиной; и полифосфатами АТФ, АДФ, ИТФ и специфичным дипептидным ингибитором кбз-Val-Phe . L-тозиламид---фенилэтилхлорметилкетон, пепстатин, апротинин, ФМСФ, бестатин, фосфорамидон, ингибиторы трипсина из сои и лимы не влияют на активность кальпаина.

Кальпаин является Ca+-зависимым металлоферментом. По чувствительности к ионам Ca+ выделяют три формы фермента:

а) CANP I (mCANP) – кальпаин, активируемый микромолярными концентрациями кальция, проявляет половину максимальной активности при концентрации ионов Ca+ около мкМ, максимальную – около мкМ ;

б) CANP II (mCANP) – кальпаин, активируемый милимолярными концентрациями кальция, проявляет половину от максимальной активности при концетрации кальция - мкМ, максимальную – - мМ ;

в) CANP III – проявляет максимальную активность при концентрации Ca+ мкМ, подвергается быстрому автолизу, после чего проявляет максимальную активность в присутствии, мкМ Ca+ .

Пептидное картирование трёх форм кальпаина с различной чувствительностью к ионам Ca+ показало, что все три формы состоят из общих пептидов, достоверных отличий между этими формами не обнаружено. Моноклональные антитела, полученные к CANP II, в одинаковой степени реагируют и с CANP I и III .

CANP также активируется ионами Sr+ и Ba+, ионы Cu+, Pb+ и Zn+ ингибируют его, другие двухвалентные ионы не влияют на активность фермента .

И m- и mCANP могут быть представлены как одиночной полипептидной цепью с молекулярной массой около кДа, так и гетеродимерами, состоящими из одной большой субъединицы с молекулярной массой около кДа и - кДа и малой субъединицы, причём молекулярная масса малой субъединицы в зависимости от источника и способа выделения может колебаться от кДа до кДа . Кроме того, имеются сообщения об обнаружении трёх высокомолекулярных форм CANP с молекулярной массой в области - кДа и низкомолекулярной формы (- кДа) . Все формы имели очень близкие, но не идентичные иммунологические свойства. В присутствии ионов Ca+ все формы CANP подвергаются быстрому автолизу . По-видимому, такая гетерогенность CANP может быть обусловлена не только существованием всех этих форм in vivo но и появлением их в результате автолиза при очистке. Следует также отметить, что для активации CANP II и III необходимы концентрации Ca+, значительно превосходящие физиологические, поэтому в организме эти формы являются, фактически, проферментами.

И кальпаин I, и кальпаин II в нервной ткани обнаруживаются как в растворимой, так и в связанной с мембранами и цитоскелетом формах, причём если на долю мембраносвязанной mCANP приходится -% от общего количества mCANP в клетке, то на долю мембраносвязанной mCANP приходится около % от общего количесва mCANP . Мембраносвязанная форма CANP ассоциирована преимущественно с миелином, но обнаруживается и в синаптических мембранах .

CANP обнаружена практически во всех тканях млекопитающих. Её содержания в ЦНС достаточно высокое . Наибольшая активность кальпаина обнаруживается в спинном мозге, несколько меньше – в амигдале, среднем мозге и белом веществе мозжечка. Активность фермента в коре больших полушарий и сером веществе мозжечка достаточно низкая . То есть, наиболее высокое содержание кальпаина наблюдается в богатых миелином областях. Фермент обнаружен как в нейронах, так и в глии . Он локализован преимущественно в нейронах неокортекса и пирамидных нейронах гиппокампа, идентифицирован в перикарионе и проксимальных дендритах этих нейронов .

CANP расщепляет большинство белков цитоскелета и нейрофиламентов, белки микротрубочек, основной белок миелина, глиальный фибриллярный кислый белок, тубулин, спектрин, миофибриллярные белки и окисленную B цепь инсулина, виментин, рецептор фактора роста эпидермиса, быстро транспортируемые белки, cdk активатор белка p, эукариотический фактор инициации G . Кальпаин также активирует кальций-активируемую фосфолипид-зависимую протеинкиназу, осуществляет ограниченный протеолиз фодрина . Имеются сведения о том, что CANP расщепляет предшественник киоторфина, динорфин -, BAM-P, a- и b-неоэндорфины, ангиотензин I и нейротензин, а также синтетические субстраты Suc-Leu-Met-NHMec, Suc-Leu-Tyr-NHMec, Boc-Val-Leu-Lys-NHMec, Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-NHMec, Boc-Leu-Thr-Arg-NHMec .

Активность фермента подавляется эндогенными ингибиторами тиоловых протеиназ цистатинами, кининогенами, ингибиторами тиоловых протеиназ из плазмы крови . Кроме этих неспецифичных ингибиторов, в различных тканях животных, в том числе и мозге, обнаружены специфичные ингибиторы CANP – кальпстатины, не влияющие на активность других протеиназ. Ингибиторы из разных тканей имеют несколько отличающиеся свойства, их молекулярная масса колеблется от кДа до кДа. Однако высокомолекулярные кальпстатины, имеющие несколько ингибиторных центров, могут подвергаться протеолизу, при этом образуются фрагменты, сохраняющие ингибиторную активность, но обладающие меньшим числом связывания с ферментом. Молекулярная масса самого короткого фрагмента, сохраняющего ингибиторную активность, составляет кДа . То есть, все многообразные формы кальпстатинов, обнаруженные в различных тканях, могут, вероятно, образовываться из одного предшественника в результате его протеолитического расщепления различной глубины. При взаимодействии кальпстатина с CANP происходит протеолиз кальпстатина, при этом образуются связанные с ферментом фрагменты, подавляющие его активность. Распределение ингибитора CANP в ЦНС соответствует таковому CANP, в особенности mCANP .