г) доведите концентрацию до 5 мг/мл и храните в аликвотах при –70°С.

4.1.2 Реактивы для отжига, расщепления и анализа гелей

Для отжига, реакций расщепления и анализа гелей в процессе РНКазного расщепления требуются следующие реактивы:

1. Тестируемая ДНК – Тестировать можно геномную или клонированную ДНК, амплифицированную в ПЦР, просто клонированную и неамплифицированную геномную ДНК – Получение ДНК в ПЦР описано в разд. 4. Клонированную и неамплифицированную геномную ДНК следует предварительно обработать рестриктазами для последующего количественного учета, а также для достижения максимально эффективной денатурации и реассоциации с зондом. Обработайте ДНК рестриктазами, выщепляющими тестируемый фрагмент, удалите ферменты фенольной экстракцией, сконцентрируйте ДНК, осадив ее этанолом. Ресуспендируйте в ТЕ-буфере в концентрации 100 мкг/мл.

2. Буфер для гибридизации. Для приготовления 10 мл необходимо: 80% формамида 8 мл деионизованного формамида 50 мм PIPES буфера, 1 мл 0,5 М PIPES, рН 6,4 рН

Не автоклавируйте Примечание: приобретайте формамид высокого качества и деионизируйте, осторожно перемешивая с ионообменной смолой Dowex AG50W или ее аналогами в течение 30 мин при комнатной температуре. Используйте примерно 2 г смолы на 100 мл формамида. Соберите формамид, профильтровав его через ватмановскую бумагу 1 ММ и храните в плотно закрытых пробирках при –20°С или –70°С.

Некоторые партии формамида содержат примеси, разрушающие РНК, особенно при высоких температурах. Это приводит к появлению на радиоавтографах высокого фона продуктов реакции РНКазного расщепления. Если остро встает проблема с фоном, рекомендуем перекристаллизовывать формамид перед использованием.

4.2 Методы

4.2.1 Синтез РНК-зондов

Описывается синтез РНК-зондов путем транскрипции in vitro клонированных ДНК, несущих фаговый промотор. Заметим, что удельная активность таких РНК-зондов ниже, чем полученных стандартным способом и традиционно используемых при тестировании геномных ДНК. Такой активности достаточно для работы с одной десятой от общего количества ДНК, получаемой в ПЦР, или с очень небольшим объемом клонированной ДНК – Преимущество этих зондов состоит в том, что они сохраняют стабильность более 1 нед. Кроме того, длинные зонды с выступающими концами легче синтезировать так как при этом нуклеозидтрифосфаты не лимитируют реакцию транскрипции. Если исследуется геномная ДНК и не проводится ПЦР, то следует использовать зонды с высокой удельной активностью. Важно, чтобы концентрация меченого NTP в начале транскрипции была не менее 10 мкМ, поэтому для синтеза высокоактивного зонда требуется 40–80 мкКи меченого NTP.

1. В стерильной микроцентрифужной пробирке смешайте в следующем порядке:

9 мкл воды,

1 мкл рестрицированной матричной ДНК,

1 мкл смеси 3-NTP,

1 мкл «холодного» GTP,

1 мкл GTP,

2 мкл DTT,

2 мкл БСА,

2–5 единиц плацентного ингибитора РНКазы, 2 мкл 10Х буфера для транскрипции.

2. К смеси добавьте 3–5 единиц РНК-полимеразы фагов SP6, Т7 или ТЗ.

3. Инкубируйте 1 ч при 40°С, чтобы прошла транскрипция.

4. Добавьте 1 мкл ДНКазы I для разрушения матричной ДНК; инкубируйте 20 мин при 37? С.

5. Добавьте 10 мкг тРНК-носителя, 10 мкл воды и 20 мкл ацетата аммония и проэкстрагируйте один раз 2FC.

6. После экстракции водный слой осадите этанолом; ресуспендируйте осадок в 80 мл воды, 20 мл ацетата аммония и снова осадите этанолом.

7. Ресуспендируйте осадок РНК в 200 мкл ТЕ-буфера, содержащего 0,1% ДСН. Храните при –20°С.

4.2.2 Реакции отжига и расщепления

Первоначально реакцию гибридизации между меченым РНК-зондом и небольшим количеством комплементарных последовательностей из нескольких микрограмм суммарной геномной ДНК проводили с молярным избытком РНК – Сейчас, когда за счет амплификации ДНК в ПЦР удается получать большие количества специфических фрагментов ДНК, нет необходимости использовать избыток зонда. В описываемых ниже экспериментах используется по существу избыток тестируемой ДНК – Эта модификация позволяет увеличить отношение сигнала к фону, так как в этом случае уже не приходится удалять остатки длинного зонда с помощью РНКазной обработки.

При постановке эксперимента полезно иметь следующие контроли:

контроль 1: неспецифическая гибридизация зонда с тРНК-носителем;

контроль 2: положительный контроль на дикий тип – реассоциация зонда с клонированным фрагментом ДНК дикого типа;

контроль 3: зонд реассоциируют с известным мутантным фрагментом геномной ДНК, клонированным или полученным в ПЦР. Это дает возможность оценить эффективность расщепления неспарен, ных участков.

1. В стерильной микроцентрифужной пробирке смешайте следующие компоненты:

1 мкл амплифицированной в ПЦР геномной ДНК в концентрации примерно 100 мкг/мл или 1 мкл рестрицированной клонированной ДНК,

1 мкл меченого РНК-зонда, 30 мкл буфера для гибридизации.

2. Прогрейте смесь 10 мин при 95–100°С на кипящей водяной бане.

3. Воспользуйтесь микроцентрифугой, чтобы собрать конденсат на дне пробирки.

4. Инкубируйте смесь 60 мин при 40–45°С, чтобы произошла реассоциация между зондом и комплементарными ему последовательностями в тестируемом фрагменте геномной ДНК.

Примечание: по оригинальной методике гибридизацию проводят в течение 10–12 ч. Считается, что за это время реакция реассоциации между фрагментами геномной ДНК и РНК-зондом достигает насыщения. В клонированных и амплифицированных в ПЦР фрагментах геномной ДНК доля последовательностей-мишеней намного больше, поэтому время гибридизации можно значительно уменьшить. Сокращение сроков инкубации облегчает проведение эксперимента и уменьшает деградацию зонда. 5. Добавьте 350 мкл смеси РНКазы с РНКазным буфером. Как следует перемешайте встряхиванием. Эта смесь представляет собой буфер для РНКазной реакции с разведенной в нем до концентрации 40 мкг/мл прокипяченной РНКазой А и тРНК-носителем в концентрации 20 мкг/мл. Раствор можно приготовить за несколько часов до использования и хранить во льду. На 5 мл смеси надо 5 мл буфера для РНКазной реакции, 100 мкл исходного раствора прокипяченной РНКазы А, 20 мкл тРНК. Примечание: в большинстве наших опытов по РНКазному расщеплению концентрация РНКазы А была 40 мкг/мл. Однако, используя фермент из другой партии, мы обнаружили, что эта концентрация слишком велика – фермент в таком количестве разрушал гибриды РНК – ДНК – Положительных результатов удалось достичь, снизив его концентрацию до 4 мкг/мл. Поэтому мы рекомендуем каждую новую партию РНКазы перед использованием калибровать в пределе концентраций от 2 до 40 мкг/мл. Для калибровки желательно использовать как мутантный контрольный образец, так и контрольный образец дикого типа. В оптимальной концентрации РНКаза А эффективно расщепляет неспаренные участки в мутантном образце и дает фоновый сигнал в контроле дикого типа.

6. Инкубируйте 60 мин при 25°С.

Примечание: по оригинальной методике инкубацию проводили в течение 30 мин. За это время РНКаза А расщепляет многие неспаренные участки лишь частично, что приводит к появлению радиоактивных сигналов в участках геля, соответствующих фрагментам дикого типа. При более длительной обработке удается расщепить эти уже частично расщепленные РНКазой сайты полностью. Легче всего интерпретировать результаты РНКазной обработки, отбирая в процессе реакции аликвоты после 30, 60 и 90 мин инкубации. В ряде случаев полуторачасовая обработка бывает чрезмерной и приводит помимо прочего к деградации концевых областей фрагментов РНК. Поэтому если кинетика реакции не исследована, то оптимальным временем обработки следует считать примерно 60 мин.