При сравнении аминокислотных последовательностей множества различных миеломных белков выявилась поразительная особенность, имеющая важный и неожиданный генетический подтекст. N-концевая часть последовательно как L-, так и Н-цепей чрезвычайно изменчива, а С-концевая - постоянна, пример, если сравнить аминокислотные последовательности большого числа различных миеломных х-цепей (каждая длиной около 220 аминокислот) окажется, что С-концевые половины у них одинаковы или различаются незначительно, тогда как N-концевые половины все разные. Таким образом, L-цепи содержат константную областьпримерно из 110 аминокислот и вариабельную областьтакой же длины. N-концевая вариабельная область Н-цепи тоже состоит приблизительно из 110 аминокислот, а константная, в зависимости от класса антител, - из 330 или 440 аминокислот.

Именно N-концевые части L- и Н-цепей совместно образуют ант связывающий участок, и вариабельность их аминокислотных последователь- ностей обеспечивает структурную основу для разнообразия таких участков. В связи с существованием вариабельной и константной областей в молекулах антител возникают важные генетические проблемы. Но еще до того как стало возможным прямое изучение этих вопросов, в результате исследования миеломных белков выяснились другие черты структуры антител.

Каждая L- и Н-цепь содержит по три гипервариабельных области, которые совместно формируют антиген‑связывающий участок

Только часть вариабельной области непосредственно участвует в связывании антигена. Этот вывод вначале был сделан в результате оценки максимальных размеров антиген-связывающего участка. Первые измерения, в которых «молекулярными линейками» служили олигомеры разной величины, были проведены с использованием антител к декстрану - полимеру D-глюкозы. Так как для ингибирования связывания декстрана с антителами к нему применены сахариды, трисахариды и олигосахариды большей длины, состоящие остатков глюкозы, их действие возрастало с увеличением длины цепи примерно до шести мономеров; с олигосахаридами большей длины эффект не увеличивался. Это позволяло предполагать, что наиболее крупные антиген-связывающие участки могут контактировать самое большее с пятью или шестью сахарными остатками антигена. Поэтому казалось крайне маловероятным, что все 220 аминокислот вариабельных областей L- и Н-цепей вносят непосредственный вклад в построение антиген-связывающего участка. И действительно, теперь ясно, что связывающий участок антитела формируют всего лишь около 20-30 аминокислотных остатков вариабельной области каждой из цепей. Первым свидетельством в пользу этого явились данные об аминокислотных последовательностях, которые показали, что различия между вариабельными областями как в L-, так и в Н-цепях в основном ограничены тремя небольшими гипервариабельными областями в каждой цепи. Остальные части, известные под названием структурных областей, относительно константны. Эти данные позволяли предсказать, что антиген-связывающий участок образуют всего лишь 5-10 аминокислот каждой гипервариабельной области. Это предсказание было впоследствии подтверждено рентгеноструктурным анализом антител.

2. Молекулярные механизмы многообразия антител

После ознакомления с тем фактом, что громаднейшее разнообразие антител является необходимым условием правильного функционирования защитной системы организма, рассмотрим обеспечивающие это условие механизмы.

Каждая L- и Н-цепь кодируется более чем одним генным сегментом

Участие необычных генетических механизмов в образовании антител стало очевидным задолго до того, как стало ясно, какой вклад вносят эти механизмы в разнообразие антиген-связывающих участков. Как уже говорилось изучение аминокислотных последовательностей миеломных белков показало, что каждая цепь иммуноглобулина состоит из вариабельной (V) и константной (С) областей, и тогда возник вопрос: как такие цепи кодируются в геноме? Уже в то время предполагали, что V- и С-области каждой из цепей могут кодироваться двумя отдельными генами, которые каким-то образом соединяются перед экспрессией.

Первые прямые данные о перестройке ДНК в процессе развития В-клеток были получены в 1976 г. в экспериментах, в которых ДНК из ранних мышиных эмбрионов, неспособных к выработке антител, сравнивали с ДНК из клеток мышиной миеломы, вырабатывающих антитела. Эти два вида ДНК переваривали рестрикционной нуклеазой и полученные фрагменты гибридизо-вали с радиоактивными последовательностями ДНК, приготовленными путем копирования in vitro V- или С-последовательности молекул информационной РНК для L-цепей, выделенной из клеток миеломы. Как показали результаты этих опытов, специфические V- и С-кодирующие последовательности находились у эмбрионов в разных рестрикционных фрагментах ДНК, а в клетках миеломы – в одном и том же рестрикционном фрагменте. Таким образом, у зародыша, где гены иммуноглобулинов не экспрессируются, последовательности ДНК, кодирующие V- и С-области той или иной цепи, локализуются в различных участках генома; между тем в клетке миеломы, где уже образуются цепи иммуноглобулинов, эти две последовательности соединены вместе.

Сейчас известно, что для каждого типа цепей иммуноглобулинов –легких цепей х, легких цепей λ и тяжелых цепей – существует отдельный «пул» (обширная группа) генов, которые могут быть использованы при синтезе каждой отдельной полипептидной цепи. Каждый такой пул содержит набор различных V-генов, расположенных на сотни тысяч нуклеотидов «выше» (т.е. ближе к 5'-концу кодирующей цепи ДНК) одного или нескольких С-генов. В процессе развития В-клеток любой из V-геновможет быть транслоцирован таким образом, что он окажется рядом с определенным С-геном. Тогда, после того как произойдет такая перестройка ДНК, может синтезироваться цепь иммуноглобулина.

Пулы генов, кодирующие х-, λ- и Н-цепи, находятся в разных хромосомах. У мыши пул генов х в хромосоме 6 содержит один С-ген (Сх) и большой набор V-генов (Vxl, VX2, VX3 .). Пул генов λ, в хромосоме 16 содержит только два V-гена (Vλl и Vλ2), каждый из которых ассоциирован с одним или двумя разными С-генами С λ. Пул тяжелых цепей, находящийся в хромосоме 12, содержит большой набор V-генов (Vh) и упорядоченную группу различных С-генов, каждый из которых кодирует отдельный класс тяжелых цепей (Сα, Сβ, Сε и Сλ) (рис. 17-40). В случае тяжелой цепи первоначальная транслокация Vн-гена всегда переносит его близко к Сμ-гену, поэтому первым антителом, синтезируемым развивающейся В-клеткой, всегда оказывается молекула IgM.

На самом деле эти пулы генов сложнее, чем показано на рис. 17-40. Вместо того чтобы кодироваться одним-единственным V-геном, как предполагалось вначале, каждая V-область полипептидной цепи кодируется двумя или тремя отдельными генными сегментами,которые объединяются в функциональный V-ген только тогда, когда происходит перестройка ДНК, соединяющая вместе V- и С-кодирующие области. Как мы увидим, такое объединение различных V-сегментов, приводящее к образованию гена V-области, непосредственно увеличивает разнообразие антиген-связывающих участков.