Все операции по подготовке и выращиванию трансформирующих культур проводят в стерильных условиях с соблюдением правил и норм, разработанных и утвержденных для производств микробного синтеза. Однако внесение стероидного субстрата на трансформацию (в растущую на полноценной питательной среде культур при использовании бактерий или в водную суспензию неразмножающихся клеток — в случае применения грибного мицелия) и сам процесс трансформации, как правило, проводят не стерильно. Для уменьшения вероятности загрязнения используют стерильную воду при приготовлении суспензии стероидных субстратов, поскольку сами стероиды обычно неустойчивы в условиях автоклавирования. Одним из вариантов решения этой проблемы может служить способ внесения стероидного субстрата в питательную среду до засева ее трансформирующей культурой в момент, когда температура среды после автоклавирования снизится до 80°С и безопасна для субстрата. После выдержки в течение 30 мин среду со стероидом охлаждают до 33°С и в нее стерильно вносят трансформирующую культуру.

Используют культуру-трансформатор в стадии замедления роста, когда питательные компоненты среды в значительной степени израсходованы, а сильно разросшаяся культура подавляет рост других микроорганизмов. Однако и эти меры не полностью предохраняют трансформационную среду от загрязнения посторонней микрофлорой. В последней могут оказаться виды, способные отрицательно влиять на ход трансформации.

Применяемая в лабораторных условиях стерилизация суспензий стероидов ультразвуком неприемлема для промышленных масштабов.

4. Примеры промышленного использования микробиологических трансформаций

Получение гидрокортизона (кортизола) из вещества S осуществляется с помощью С. Linata.

Процесс включает следующие стадии:

1. Выращивание трансформирующей культуры (I стадия) производят путем трех последовательных генераций на питательной среде, содержащей сахарозу, дрожжевой автолизат и сложный набор неорганических солей:

Крышку инокулятора перед засевом обрабатывают водным раствором формалина, аппарат и все помещение облучают бактерицидной лампой и весь процесс выращивания трансформирующей культуры проводят в стерильных условиях. Далее полученная трансформирующая культура поступает в сепаратор, откуда отделенный мицелий в виде водной суспензии передается в ферментер для проведения основной реакции трансформации вещества S.

2. Трансформация вещества S (II стадия) также начинается со стерилизации ферментера и воздушного фильтра водным раствором формалина. Особое внимание уделяется размолу стероида на микромельнице и получению суспензии его в стерильной воде с содержанием стероида 1 г/л. Для предотвращения развития посторонней микрофлоры используется добавка антибиотика. Перемешивание и аэрация осуществляются, как и на предыдущей стадии, так же используются и пеногасители.

3. Выделение продукта трансформации — гидрокортизона (III стадия). Культуральная жидкость вместе с мицелием после II-й стадии поступает на сепарацию. Отделенный мицелий промывается, промывные воды присоединяются к основной культуральной жидкости. Далее производится экстракция-сепарация продукта трансформации из водной среды органическим растворителем. Осветленный активированным углем экстракт подвергается многократному упариванию с различными растворителями, осветлению, снова упариванию досуха и промывке подходящим растворителем. Последние приемы обработки готового технического продукта обычны для технологии получения многих органических веществ и лекарственных препаратов. Получение чистых лекарственных форм гидрокортизона проводится традиционными методами.

Трансформация гидрокортизона в преднизолон

Выращивание трансформирующей культуры М. gtobiforme осуществляется такими же последовательными этапами и в тех же аппаратах при тех же условиях аэрации и перемешивания, далее проводится трансформация гидрокортизона с помощью названной дегидрирующей культуры. Выделение готового продукта — преднизолона, осуществляется также путем экстракции-сепарации из культуральной жидкости, отличаясь лишь набором растворителей.

В настоящее время интенсивно разрабатываются методы использования мелкокристаллических стероидных субстратов. Микронизация субстрата до размеров частиц в несколько микрометров и внесение в ферментационную среду без растворителя позволяет повысить исходную концентрацию стероидного субстрата до 20—50 г/л.