В представленных работах чаще всего изучаемой моделью являются метафазные хромосомы, полученные из клеток китайского хомячка и человека, приготовленные для прямого кариотипирования, а также для анализа кариотипа с кратковременным или длительным культивированием клеток. Для анализа генетического материала используются однопараметрические проточные системы, где проводится анализ и сортировка хромосом по интенсивности флуоресценции в комплексе с такими флуорохромами, как PI, EtBr, Ho 33258, а также применяются высокоразрешающие проточные цитометры с двухлазерной системой, которые обеспечивают бивариантный анализ ДНК, меченный двумя флуорохромами. Большей частью используют сочетание Но 33258, специфически связывающийся с АТ-богатыми участками ДНК, и хромомицин А3, селективно взаимодействующий с ГЦ-парами.

Данные, полученные при помощи автоматизированных систем, представляются в виде гистограмм, так называемых проточных кариограмм. О качестве анализа свидетельствует высокое разрешение гистограмм, Которые характеризуются множественными узкими пиками, относящимися к различным классам хромосом. Количество пиков в большинстве случаев соответствует набору хромосом, которое характерно для данного индивидуума. При исследовании клеток зародыша китайского хомячка методом проточного кариотипирования на этапе экспоненциального роста были получены все 11 пиков, соответствующие 11 парам хромосом самки, исследуемого животного (J.A.Steinkamp, 1984).

Обычно применяемые цитогенетические методы не позволяют идентифицировать Y-хромосому из G- и F-групп хромосом человека. Применение проточной цитометрии позволяет решить эту задачу. Так, на лимфоцитах, выделенных из периферической крови доноров-мужчин, с кратковременным культивированием (52 ч) и добавлентем колцемида была показана возможность определения позиции Y-хромосомы по интенсивности ДНК-флуоресценции (Но 33258) в виде пика на проточной кариограмме. У 17 обследуемых доноров позиция Y-хромосомы на гистограмме варьировала. В некоторых наблюдениях пик Y-хромосомы находился между 19 и 20 хромосомами, в других – между 20-й и 17-й. В 70% случаев Y-хромосома была контаминирована с 20-й.

Из работ, посвященных хромосомному анализу, известно, что при использовании однолазерной проточной системы может быть идентифицировано около 15 хромосом человека, исключая Y-хромосому. Применение двухлазерной системы (FACS-11) позволяет по интенсивности флуоресценции распознать около 20 популяций хромосом в метафазных пластинках и, что особенно ценно, идентифицировать маленькие аутосомы человека (M.Lalande, R.R.Schreck, R.Hoffman, S.A. Latt, 1985). В этом случае помимо флюорохромов Но 33258 и хромомицина А3 в комплекс субстрат-флюорохром вводится третий краситель: нетропсин или дистамицин А. Это способствует получению дополнительной информации о специфике хромосом, т.е. определению структурных особенностей нормальных и атипических хромосом. В результате бивариантного проточного анализа с дополнительной окраской хромосом авторам удалось на модели клеточной линии человеческих лимфобластов получить высокое разрешение метафазных пластин с последующим изучением структурной перестройки хромосом и идентификацией аномальных.

Проточный бивариантный анализ, используемый для кариотипа хромосом, апробирован на достаточно широком спектре клинического и экспериментального материала, включая опухоль прямой кишки, культуры клеток асцитической жидкости, лимфоцитов периферической крови и фибробластов человека (V.G.Enchev, K.G.Tsanev, 1985).

4.Наиболее употребительные методики, используемые в цитометрии клеточного цикла.

При проточной цитометрии можно сканировать от 100 до нескольких тысяч клеток в секунду, что позволяет очень быстро получить достоверные результаты. Однако таким способом можно анализировать только очень разбавленные клеточные суспензии. Солидные ткани необходимо сначала дезагрегировать, что всегда сопровождается нарушением морфологии. Клетки монослоя обычно диспергируют обработкой трипсином в присутсвии ЭДТА.

Дезагрегация свежих солидных опухолей

Методы дезагрегации клеток можно подразделить на три группы:

– методы, основанные исключительно на механической обработке;

– ферментативные методы;

– методы выделения ядер

Самые простые и быстрые методы дезагрегации включают только механическую обработку тканей. Эти методы особенно хороши для рыхлых тканей (например, лимфатических узлов) и позволяет получать густые суспензии клеток за несколько минут. Для получения неочищенных клеточных суспензий можно использовать аспираты солидных опухолей, взятые с помощью шприца.

Ферментативный метод позволяет получить достаточно концентрированную клеточную суспензию из разнообразных опухолей, но при больших затратах времени.

Для выделения ядер (обычно из тканей, частично дезагрегированных механическим путем) разработаны различные методы, основанные на использовании ферментов, детергентов или тех и других. Детальная процедура дезагрегации тканей, окрашивания препаратов, получения результатов и их анализа для суспензии ядер разработана Винделовом и др. (L.L.Vindelov, I.J.Christensen, 1990).

Цель дезагрегации состоит в получении с высоким выходом суспензии интактных изолированных клеток или ядер, достаточно хорошо соответствующей исходному образцу ткани. Выбор способа дезагрегации зависит от типа ткани, размеров препарата, целей исследования, а иногда от быстроты и стоимости метода.

Суспендирование архивных препаратов, залитых в парафин

Методика исследования ДНК с помощью проточной цитометрии суспензии ядер, полученной из заключенных в парафин архивных препаратов, была впервые описана в 1983 г. (D.W.Hedley, M.L.Friedlander, I.W.Taylor, 1983). Эту методику можно использовать в модифицированном виде для анализа самых разнообразных опухолей. Это дает целый ряд преимуществ:

– можно проводить обширные ретроспективные клинические исследования;

– значительно упрощается изучение редко встречающихся патологий;

– парафиновые срезы легко транспортировать, что позволяет проводить цитометрические исследования в специальных центрах.

Недостатки метода состоят в том, что:

– качество получаемых результатов, как правило, не очень высокое;

– нельзя использовать внутренний ДНК-стандарт.

Качество результатов можно повысить, если немного усовершенствовать фиксацию тканей (C.E.Gillett, R.S.Camplejohn, S.M.O´Reily, 1990). Хороший эффект дает фиксация в формалине при нейтральном рН при 4ºС в течение ночи. Следует избегать нагревания ткани (если только оно не является абсолютно необходимым при ее обработке) или неоправданно длительной фиксации.

Окрашивание ДНК

При окрашивании клеточной ДНК с целью последующего определения ее содержания с помощью проточной цитометрии следует учитывать:

– специфичность красителя по отношению к ДНК;

– его спектральные характеристики: интенсивность флуоресценции и возможность ее регистрации имеющимися в продаже приборами;

– стоимость и удобство в работе (растворимость, стабильность и т.д.)