ПОДГОТОВКА ВОЛОСА К ИССЛЕДОВАНИЮ, ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ВЫДЕЛЕННОЙ ДНК

Перед началом работы образцы исследуемых волос моют в дистиллированной воде 1 ч при легком покачивании (на качалке, на магнитной мешалке и т. п.). Волосы, загрязненные кровью, спермой или слюной, моют в 1% водном растворе глицина 1 ч при покачивании, затем ополаскивают дистиллированной водой. Глицин, являясь слабым детергентом, повышает растворимость белков и способствует их отмыванию. Кроме того, отмыванию волос от биологических примесей способствует их предварительное выдерживание (1 - 2 ч) при низкой температуре (-20 ¸ -70 °С), а также в растворе абсолютированного спирта.

Основным критерием того или иного метода экстракции ДНК из волос, как и из других источников, служит количественный выход хорошо очищенной ДНК. Известно, что концентрация ДНК, выделяемой из луковичной части вырванных живых волос, может достигать 200 нг на один волос. В то же время содержание ДНК в фолликулах выпавших волос с отмершей луковицей уменьшается до 10 - 20 нг. Содержание же ДНК в стержневой части волоса практически невозможно измерить известными в настоящее время методами, в том числе методом УФ-спектроскопии или флуориметрии.

В данной работе эффективность метода экстракции ДНК оценивали путем проведения реакции амплификации на мини-сателлиты с парой праймеров системы Д1 S80, дающей после проведения амплификации специфические ДНК-фрагменты размером от 400 до 800 пар оснований.

Амплификацию проводили в следующем режиме:

94 °C - 4 мин;

94 °C ü

60 °C ý 30 циклов по 1 мин;

72 °C þ

72 °C - 8 мин.

Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия, нанося по 25 мкл реакционной смеси, визуализировали в УФ-свете и документировали фотографированием. В качестве контроля амплификации использовали фрагменты ДНК с известной молекулярной массой.

Положительный результат реакции амплификации указывает на высокую степень очистки исследуемой ДНК. Особенно это важно при выделении ДНК из стержня волоса, содержащего много меланина. Известно, что значительное количество соединений различной химической природы способны ингибировать реакцию амплификации и даже полностью блокировать синтез ДНК в процессе амплификации. Процесс ингибирования ПЦР носит ярко выраженный концентрационный характер, т. е. увеличение концентрации ингибитора приводит к уменьшению выхода целевого продукта амплификации. Меланин полностью ингибирует ПЦР в концентрации 15 нг в 100 мл реакционной смеси. В хорошо очищенном экстракте не должно быть ингибирующего действия меланина.

МЕТОДИКА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ СТЕРЖНЯ ВОЛОСА

Методика используется при исследовании всех вариантов волос, в том числе и волоса, не имеющего луковичной части. При отсутствии луковичной части волоса исследуют прикорневую часть стержня волоса длиной не менее 3 см и не более 10 см. Последовательность выполнения методики:

1. Волос микроскопируют и отмывают (как описано выше).

2. Волос режут на кусочки длиной около 1 см и помещают в пробирку "Эппендорф" (V = 1,5 мл).

3. В пробирку с волосом добавляют 500 мкл буфера I, 20 мкл 1 М ДТТ и 15 мкл раствора (10 мг/мл) протеиназы К. Пробирку помещают в термостат и выдерживают при температуре 56 °С в течение 6 ч. В процессе выдерживания волос частично растворяется.

4. Пробирку помещают на вортекс (прибор для встряхивания) и встряхивают 30 с при средней скорости.

5. Затем к раствору в пробирке добавляют 20 мкл 1 М ДТТ и 15 мкл раствора (10 мг/мл) протеиназы К. Пробирку помещают в термостат и выдерживают при температуре 56 °С в течение 12 ч (ночь), после чего волос полностью растворяется.

6. Пробирку вновь помещают на вортекс и встряхивают 30 с при средней скорости, затем центрифугируют 1 мин при 10 000 - 15 000 об/мин. После центрифугирования продукты лизиса волоса переходят в супернатант.

7. Супернатант отбирают в чистую пробирку "Эппендорф", добавляют 600 мкл смеси фенол-хлороформ, закрывают крышкой, помещают на вортекс и перемешивают 15 с на средней скорости, а затем центрифугируют 3 - 5 мин при 10 000 - 15 000 об/мин. Наблюдают разделение на две фазы: верхняя водная фаза содержит выделяемую ДНК, нижняя – фенол-хлороформ.

8. Верхнюю водную фазу переносят в чистую пробирку "Эппендорф" (V = 1,5 мл) и добавляют 500 мкл водонасыщенного н-бутанола с целью удаления остатка фенол-хлороформа, который может повредить мембрану "Центрикона-100". Помещают на вортекс, встряхивают 15 с на средней скорости и центрифугируют 1 мин при 10 000 - 15 000 об/мин при комнатной температуре. Водная фаза собирается на дне пробирки, верхний слой – удаляют.

9. "Центрикон-100" собирают по соответствующей инструкции и согласно рис. 3.

10. Нижнюю водную фазу, содержащую экстракт ДНК, фильтруют и концентрируют на "Центриконе-100", фильтрующем примеси с молекулярным весом более 100 000 дальтон. При данной фильтрации меланин волос и его производные, как более низкомолекулярные, проходят через мембрану "Центрикона-100".

11. Добавляют 1,5 мл ТЕ-буфера в верхний резервуар колонки "Центрикона-100". Сверху добавляют около 500 мкл экстракта ДНК. Пробирку закрывают парафильмом и, не касаясь раствора, прокалывают парафильм в нескольких местах тонкой чистой иглой. Центрифугируют на центрифуге с фиксированным углом ротора. Необходимо пересчитать скорость центрифугирования для используемой центрифуги в об/мин так, чтобы она составляла 1000g. Ниже приведена формула пересчета. Нельзя центрифугировать со скоростью более 1000g, во избежание повреждения мембраны "Центрикона-100". Время центрифугирования подбирают опытным путем так, чтобы ДНК сконцентрировалась в объеме 4 - 6 мкл, обычно не более 20 мин при комнатной температуре. После центрифугирования удаляют содержимое нижнего резервуара.

12. В верхний резервуар колонки "Центрикона-100", где концентрируется раствор ДНК в объеме 4 - 6 мкл, добавляют 2 мл ТЕ-буфера и повторяют фильтрацию 2 раза (закрыть парафильмом, проколоть его иглой, центрифугировать со скоростью 1000 g при комнатной температуре до объема 4 - 6 мкл ~20 мин, удалить содержимое нижнего резервуара, добавить 2 мл ТЕ-буфера и т. д.).

13. Профильтровав раствор ДНК 3 раза через мембрану "Центрикона-100", очистив его таким образом от примесей с молекулярным весом ниже 100 000 дальтон и сконцентрировав ДНК в заданном объеме (4 - 6 мкл), переносят раствор ДНК из верхнего резервуара в колпачок "Центрикона-100", который присоединяют к колонке верхнего резервуара и переворачивают. Центрифугируют 5 мин со скоростью 1000g при комнатной температуре. Все операции по фильтрации ДНК проводят с соблюдением максимально возможной чистоты и стерильности.

14. В колпачке "Центрикона-100" собирается выделенная ДНК, готовая к проведению ПЦР. Образец можно хранить при температуре –20 °С.