Общую численность бактерий в 1 г почвы (Nобщ.) определяли по формуле:

S × Σni

N общ. = z× s×v ×100 [кл/г], где

S – общая площадь окрашенного на стекле препарата (225 мм2);

Σni – сумма подсчитанных под микроскопом микробных клеток;

z – количество просмотренных полей зрения (15);

s – площадь одного поля зрения (1089×10-6 мм2);

v – объем образца воды, затраченный на приготовление окрашенного препарата (0,1 мл);

100 – разведение первоначального образца почвы в 100 раз.

Опыт проводили в двухкратной повторности, чтобы рассчитать доверительный интервал.

1.3 Определение численности сапротрофов и олиготрофов

Определение количества клеток сапротрофов (Nсапр.) проводили высевом на жидкую питательную среду – мясо-пептонный бульон (МПБ) [6]. Для приготовления МПБ использовали стандартную питательную среду (ИЛО «Питательные среды»). Состав МПБ, г/л: панкреатический гидролизат кильки – 17,9; NaCl – 7,7 ± 0,3; вода дистиллированная – 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность определяли при помощи метода наиболее вероятного числа (НВЧ) с использованием таблиц Мак-Креди [7].Готовилиряд предельных десятикратных разведений 1 г почвы. Для посевов использовали разведения от 10-1 до 10-7. Количество посевного материала везде составляло 1 мл, посев осуществляли в трехкратной повторности. Инкубацию проводили в термостате при 28 0С в течение 7 сут. После инкубации регистрировали рост бактерий, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки [6;7].

Для выделения олиготрофов использовали среду М2 следующего состава [11]: Na2HPO4 – 0,8 г; KH2PO4 – 0,5 г; NH4Cl – 0,5 г; MgSO4 – 0,2 г; CaCl2 – 0,1 г; FeSO4×7H2O –15 мг; дрожжевой экстракт – 0,1 г ; пептон – 0,2 г; агар – 15 г; глюкоза – 0,2 г; вода дистиллированная – 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность олиготрофов (Nолиг.) определяли методом высева по Коху [7]. Готовили ряд предельных десятикратных разведений 1 г почвы в дистиллированной воде: от 10-1 до 10-9.По 1 мл суспензии из каждого разведения вносили в три параллельные чашки Петри. Все чашки заливали расплавленной средой. Посевы инкубировали 14 сут., а затем подсчитывали количество колоний, выросших на каждой чашке и среднее число колоний, выросших из одного разведения. При этом определяли значимость различий двух повторных определений по критерию χ2, рассчитываемому по формуле [7]:

(ni – n)2

χ 2 = п ,

где пi – число колоний, выросших на первой и второй чашках, засеянных из одного разведения; п – их среднее значение.

Различие считается значимым при χ 2 не менее 3,841. Пересчет числа выросших колоний (п) на численность бактерий соответствующей группы (N) производили исходя из предположения, что одной колониеобразующей единицей (КОЕ) является отдельная микробная клетка. Для этого использовали формулу:

n×r

Nолиг. = v [кл/г],

где п – среднее число колоний на чашках Петри, засеянных из одного разведения; r – величина разведения; v – объем образца, посеянного на чашку (мл).

Кроме того, рассчитывали отношение Nсапр. к Nобщ. для каждого горизонта.

2 Результаты и обсуждение исследования

Результаты начального этапа микробиологического исследования почвенных образцов представлены в приложении 2 и на рисунке 1.

Таблица 1

Общая численность бактерий в почвенном профиле

дерновой альфегумусовой глеевой почвы

Рис. 1. Динамика общей численности бактерий в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы. N – численность бактерий

(× 109 кл/г почвы).

Как видно из табл. 1 и рис. 1, максимальное значение общей численности бактерий (Nобщ.) – 6,2×109 кл/г – наблюдали во втором горизонте, по сравнению с остальными четырьмя горизонтами. Этот факт можно объяснить тем, что два верхних горизонта исследуемой почвы обладают хорошей проницаемостью для воды и поступающего с ней органического вещества. Третий горизонт почвенного профиля уже более уплотнен, поэтому органическое вещество, накапливаясь во втором горизонте, является фактором, стимулирующим развитие в нем почвенных микроорганизмов.

Данные табл. 1 показывают, что Nобщ. достоверно снижалась с увеличением глубины залегания почвенного горизонта: от второго к пятому, самому нижнему. Полученный результат согласуется с тем фактом, что содержание органического вещества, необходимого для развития почвенных микроорганизмов, также снижается с увеличением глубины залегания горизонта. При переходе от верхнего горизонта к нижележащим изменяются также окислительно-восстановительные условия, pH и др.

Порядок величин Nобщ. в каждом горизонте был одинаков – 109 кл/г. По-видимому, в верхних более рыхлых горизонтах, куда поступает достаточное количество кислорода с поверхности, создались оптимальные условия для развития аэробных микроорганизмов. В нижележащих горизонтах содержание кислорода минимально, и прежний порядок значения Nобщ. объясняется активным развитием анаэробов.

Численность сапротрофных бактерий (Nсапр.) уменьшалась от первого горизонта к третьему, причем резкое снижение численности – более чем в 6 раз – было отмечено при переходе от первого ко второму горизонту (рис. 2А). Nсапр. (таб.2) в четвертом горизонте – 4,5×104 кл/г – была незначительно выше, по сравнению с третьим – 2,0×104 кл/г, – тогда как в пятом она опять понижалось до значения, отмеченного в третьем горизонте (рис. 2А). Как показано на рис. 2Б, численность олиготрофных бактерий (Nолиг.) последовательно снижалась с увеличением глубины залегания почвенного горизонта от 9,5×107 в первом до 1,5×107 кл/г в пятом горизонте (таб.2).

Рис. 2. Численность сапротрофов (А) и олиготрофов (Б) в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы. N – численность бактерий (кл/г почвы)

Таблица 2

Численность сапротрофных и олиготрофных бактерий в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы