5. Измерение протеолитической активности ХТР

Для изучения протеолитической активности иммобилизованного ХТР в водной среде (0,08 М ТРИС-буфер, рН 7,8, содержащий 0,1М CaCl2), использовали следующую методику. 40 мкл раствора ХТР или суспензии микросфер с ХТР добавляли в кювету на 1,5 мл, содержащую 0,15 мл 0,08 М ТРИС-буфера, рН 7,8 и 0,14 мл 0,00107 М BTEE в 50% растворе метанола (63 мл абсолютного метанола в 50 мл воды). Прирост оптической плотности регистрировали спектрофотометрически при длине волны 256 нм в течение 5 минут. При этом каждую минуту кювету встряхивали, чтобы избежать осаждения микросфер с включенным белком. Таким образом, прирост оптической плотности был обусловлен накоплением продукта ферментативного гидролиза.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Получение микрокапсул с ХТР на основе CaCO3-частиц

Полиэлектролитные микрокапсулы были получены ступенчатой адсорбцией [5] противоположно заряженных Alg и PLL на твердых CaCO3-частицах. Впервые микрочастицы из карбоната кальция были получены и применены в качестве деградируемой матрицы для получения ПЭ микрочастиц в работе [10]. Непосредственное взаимодействие эквимолярных растворов карбоната натрия и хлорида кальция при перемешивании приводит к кристаллизации малорастворимой соли CaCO3. Образующиеся в результате микрочастицы имеют сферическую форму и размер несколько микрон (микрометров?). Микрофотографии таких частиц, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа, представлены на рисунке 1. На фотографии можно видеть внутреннюю канало-подобную структуру частиц. Формирование такого рода архитектуры вызвано специфическим процессом роста частиц [21].

Для получения микросфер (Alg/PLL)3, в качестве агента для растворения CaCO3 матрицы, была использована ЭДТА (рН 7,0). Использование CaCO3 частиц позволяет проводить процесс микрокапсулирования в физиологически оптимальных значениях рН, что особенно важно для иммобилизации БАВ, в частности – белков. Первым ПЭ наносился Alg в силу отрицательного заряда CaCO3 микрочастиц (ξ-потенциал поверхности составил –12,2±2,5 мВ). В процессе последовательной адсорбции макромолекулы ПЭ проникают в поры CaCO3 микрочастиц, так как размер пор (30-90 нм) в несколько раз больше размера макромолекул ПЭ. Таким образом, во внутренних каналах микрочастиц происходит формирование интерполиэлектролитного комплекса. После растворения CaCO3 матрицы ПЭ комплекс остается стабильным [21].

Размер микросфер в растворе соответствовал размеру исходной матрицы - CaCO3 микрочастиц. Данный факт подтверждается наблюдениями за микрочастицами в процессе удаления карбонатной матрицы (оптическая микроскопия). На рисунке 2 представлены фотографии CaCO3 микрочастиц (А) и ПЭ микросфер, полученных на их основе (Б). Сохранение микросферами формы и размера, использованных для их получения матриц, говорит о придании полиэлектролитным «каркасом» существенной прочности ПЭ микросферам, в том числе по отношению к осмотическому давлению, возникающему при растворении твердой CaCO3 матрицы. Это особенно ценно, так как «осмотический шок» при растворении матрицы, покрытой оболочкой из ПЭ комплекса, вызывает увеличение размера образующихся микросфер, состоящих из ПЭ оболочки, или даже деформацию и разрушение таких ПЭ микрокапсул [22].

Известно, что адсорбция белков из раствора на твердой поверхности является результатом нескольких основных процессов [23]: а) электростатического взаимодействия между белком и поверхностью; б) взаимодействия между молекулами белков; в) изменения структуры белка. Таким образом, контакт белка с твердой поверхностью определяется как межмолекулярными, так и внутримолекулярными силами.

В процессе получения микрокапсул наносилось по 3 слоя каждого ПЭ, исходная концентрация ХТР составляла 5 мг/мл и 10 мг/мл. Анализ полученных результатов показал, что процент сорбции на 100 мг частиц при начальной концентрации 5 мг/мл составил 80% (4 мг/мл ХТР), 10 мг/мл – 41% (4,1 мг/мл ХТР). ? Включение ХТР в CaCO3 микрочастицы проводили методом адсорбции в порах (АП). О равномерном распределении фермента

2. Изучение активности иммобилизованного ХТР и биодеградации микрокапсул

Иммобилизованный в ПЭ микрокапсулы, ХТР практически полностью сохраняет свою активность (86±9% по сравнению с нативным ферментом).Данные, полученные в результате сравнения гидролиза субстрата нативным ХТР и ХТР, включенным в ПЭ микрокапсулы, представлены в виде графика на рисунке 3. Изменение оптической плотности во времени обусловлено накоплением продукта ферментативного гидролиза. Полученные данные позволяют сделать следующие выводы: а) в процессе гидролиза отсутствуют стерические затруднения при диффузии субстрата через оболочку к молекулам иммобилизованного ХТР; б) равномерное распределение фермента в частицах при адсорбции, способствует практически полному гидролизу субстрата молекулами ХТР; в) при иммобилизации не происходит изменения конформации активного центра молекул фермента.

Комлексообразование ферментов с ПЭ приводит к снижению активность или не оказывает влияния, которое зависит от природы реагирующих веществ и условий. Так, авторы работы [16] по иммобилизации лактатдегидрогеназы в сетку ПЭ комплекса, отмечают семикратное падение активности иммобилизованного фермента. В нашем случае, включение белков в ПЭ микрокапсулы, способствует сохранению их активности и получению стабильных при хранении препаратов.

С целью изучения проницаемости оболочек к действию протеолитических ферментов было исследовано влияние растворов ТР на ПЭ микрокапсулы. Как известно, ТР входит в состав секрета поджелудочной железы и является эндопептидазой, т.е. он расщепляет пептидные связи, образованные основными аминокислотами, такими, как лизин [24]. Были использованы следующие концентрации ТР: 0,05%, 0,1% и 0,2%. Результаты показали, что микрокапсулы растворились в течение часа (оптическая микроскопия). С целью доказательства сохранения активности ХТР, после биодеградации микрокапсул был проведен гидролиз субстрата полученными растворами. Спектрофотометрическое изучение показало, что ХТР сохранил активность после разрушения ТР. Результаты этого исследования представлены на рисунке 4. Прирост оптической плотности, обусловленный накоплением продукта ферментативного гидролиза, свидетельствует о сохранении активности ХТР после разрушения ПЭ микрокапсул.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные эксперименты позволяют сделать вывод, что в качестве исходной матрицы для получения ПЭ микрокапсул, содержащих ХТР, наиболее приемлемыми являются CaCO3 микрочастицы. Использование последних позволяет проводить процесс микрокапсулирования в физиологически оптимальных значениях рН на всех этапах. Это открывает большие возможности для иммобилизации широкого спектра белков с сохранением их активности. Кроме того, при растворении твердой CaCO3 матрицы, микросферы сохраняют размер и форму, что свидетельствует об их существенной прочности, в том числе по отношению к осмотическому давлению. Полученные микрочастицы с узким распределением по размерам (3-5 мкм) имеют пористую структуру, что позволяет иммобилизовать на их основе различные белки методоми физической сорбции. Высокое содержание по белку (80% в случае исходной концентрации ХТР 5 мг/мл), а также биосовместимость и биодеградация полученных ПЭ микросфер, позволяют использовать их в качестве систем доставки включенного препарата.