СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Явление флуоресценции

1.2 Развитие флуоресцентной микроскопии

1.3 Флуорохромы и флуорохромирование

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1 Объекты флуоресцентной микроскопии

2.2 Возможности флуоресцентной микроскопии

Глава 3. Использование метода люминесцентной микроскопии в исследовании микроводорослей

3.1 Выявление физиологического состояния клеток микроводорослей

3.2 Количественная регистрация интенсивности флуоресценции

3.3Оценка степени токсичности отдельных веществ для водорослей

3.4Определение содержания витаминов в растительных клетках

Заключение

Список литературы

Summary

ВВЕДЕНИЕ

Функционирование и роль микроводорослей в различных экосистемах определяется широкими адаптационными способностями, которые включают изменение структурных и физиологических свойств фотосинтетического аппарата.

Изучение модельных систем естественного фитопланктона позволяет решить ряд теоретических проблем в области исследований фотосинтеза, а также имеет практическое значение для прогнозирования развития водорослей при возрастающей антропогенной нагрузке.

Флуоресцентные характеристики фитопланктона используются для оперативного определения концентрации хлорофилла, на основе которой рассчитывается биомасса и продуктивность водорослей. Измерение концентрации хлорофилла позволяет получить сведения о фотосинтетической активности микроводорослей. [14]

В настоящее время метод флуоресцентного анализа выступает в качестве методической основы решения двух крупных проблем: интеграция биологических (растительных) систем и организация мониторинга.

Преимущество люминесцентной микроскопии, как одного из флуоресцентных методов исследования, заключается в том, что информацию о состоянии фотосинтетического аппарата и отдельных клеток можно получить за очень короткий срок при относительно малом объёме проб. [10]

Целью работы является изучение метода люминесцентной микроскопии для исследования состояния микроводорослей.

В задачи работы входило:

1. Ознакомиться с особенностями люминесцентной микроскопии, местом её среди флуоресцентных методов исследования.

2. Изучить методику выявления физиологического состояния и оценки степени токсичности отдельных веществ для клеток микроводорослей с помощью люминесцентной микроскопии.

3.Изучить методику определения содержания нефлуоресцирующих веществ – витаминов – в растительных клетках с помощью исследуемого метода.

4. Изучить методику количественной регистрации интенсивности флуоресценции методом люминесцентного микроскопирования.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Явление флуоресценции

При взаимодействии света с веществом может происходить преломление световых лучей и их рассеяние, либо поглощение фотонов молекулами, или то и другое вместе. Если произошло поглощение кванта света, то через 10-9с может происходить испускание части поглощённой энергии в виде кванта света с большей длиной волны: такое излучение называется люминесценцией. Встречающиеся в природе явления люминесценции весьма разнообразны. [5]

Различают два вида люминесценции, отличающихся по времени жизни и энергии излучаемых фотонов. Исходя из наиболее характерного качественного признака люминесценции – степени её длительности – различают флуоресценцию – свечение мгновенное, появляющееся лишь в момент возбуждения светящегося объекта, и фосфоресценцию – свечение более длительное, продолжающееся иногда весьма долго по окончании возбуждения. Изучение люминесценции позволяет судить о строении поглощающих свет молекул и участков молекул (хромофоров), а также производить их качественный и количественный анализ, выяснять физико-химические свойства среды, окружающей молекулы или их хромофорные группы. [6]

Различают собственную (первичную) люминесценцию, наблюдаемую без окрашивания, и вторичную (наведённую), которая возникает после обработки химическим агентом или красителем. [9]

Согласно закону Стокса, спектр флуоресценции лежит в более длинноволновой области по сравнению со спектром поглощения того же соединения. Это означает, что средняя энергия квантов флуоресценции меньше средней энергии поглощённых квантов.

Правило Каши относится к форме спектра флуоресценции при возбуждении объекта светом разных длин волн. Испускание квантов флуоресценции всегда происходит с нижнего возбуждённого уровня молекул, независимо от того, на каком уровне оказался электрон в результате поглощения. Т.е. какой бы длиной волны не была возбуждена молекула, излучение будет происходить из одного и того же состояния молекулы. [7]

Интенсивность флуоресценции (Iф) зависит от концентрации флуоресцирующих молекул (Z), интенсивности возбуждающего света (Iв), значение молярного коэффициента поглощения (Еλ) и величины квантового выхода флуоресценции

(Кλ): Iф=2,3*Iв* Еλ* Кλ* Z*L,

где L – длина оптического пути в объекте. Измеряемая интенсивность флуоресценции даёт информацию о величине Кλ*Z, т.е. о количестве флуоресцирующих молекул и их способности флуоресцировать (квантовый выход). Это уравнение справедливо при поглощении объектом менее 5% возбуждающего света, что обычно имеет место в физиологических опытах. При поглощении более 5% света наблюдается нелинейная зависимость. [8]

Для характеристики флуоресценции помимо её интенсивности и квантового выхода, можно использовать значения смещения максимума флуоресценции по спектру, время жизни флуоресценции молекулы и степень поляризации флуоресценции. Перечисленные параметры позволяют получить информацию о характере взаимодействия флуоресцентных молекул между собой и с окружающей их средой. [6]

1.2 Развитие флуоресцентной микроскопии

Люминесцентная микроскопия – метод микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур, входящих в их состав.

Цвет люминесценции, т.е. длина волны излучаемого света зависит от химической структуры и от физико–химического состояния микроскопируемого объекта, что и обуславливает возможность использование люминесцентной микроскопии в целях микробиологической и цитологической диагностики, для дифференцирования отдельных компонентов клеток. Первичная люминесценция присуща ряду биологически активных веществ, таких, как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А, В2, В1, некоторые антибиотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол). Вторичная, или наведённая, люминесценция возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями – флюорохромами, что позволяет проводить люминесцентно–цитологический и люминесцентно–цитохимический анализ. [16]

В истории развития люминесцентной микроскопии выделяют несколько этапов, связанных с усовершенствованием методики.