Достижения генетики и химии нуклеиновых кислот позво­лили разработать методологию генной инженерии:

—открытие явления рестрикции — модификации ДНК и выделение ферментов рестриктаз для получения специфи­ческих ферментов;

—создание методов химического и ферментативного синте­за генов;

—выявление векторных молекул ДНК, способных перенес­ти в клетку чужеродную ДНК и обеспечить там экспрессию со­ответствующих генов;

— разработка методов трансформации у различных организ­мов и отбор клонов, несущих рекомбинантные ДНК.

Составляющие методики.

Явление рестрикции — модификации ДНК впервые наблю­дали Г. Бертани и Д. Ж. Вейгль, а его суть раскрыл В. Арберг: в бактериях действуют специальные ферменты, способные спе­цифично распознать "свою" (бактериальную) ДНК от "чужой" (фаговой). Эти ферменты ограничивают возможность размно­жения фаговой ДНК в бактериях путем ее специфичной (в за­висимости от типа фермента) деградации. Такие ферменты были названы эндонуклеазами рестрикции няирестриктазами.

В 1971 г. группой Г. Смитга была выделена первая рестриктаза, специфично расщепляющая двухцепочную ДНК в строго определенных сайтах. Вскоре было установлено, что болынинство видов бактерий обладает специфичными системами рест­рикции — модификации.

В генной инженерии используют ферменты, разрывающие двухцепочную ДНК в зоне участка узнавания или на незначи­тельном фиксированном расстоянии от него. Фермент распоз­нает специфичную последовательность и разрезает ее. В пос­леднем случае образуются выступающие одноцепочечные кон­цы, получившие название "липких". В настоящее время извест­но несколько сотен таких рестриктаз, что обеспечивает возмож­ность получения различных фрагментов ДНК, содержащих же­лаемые гены.

Работы в направлении синтеза гена начались еще до 1972 г.

Так в 1969 г. появились публикации по выделению генов при помощи физических и генетических методов.

На начальном этапе развития генной инженерии широко ис­пользовался способ получения генов из природных источников, и он до сих пор применяется для создания банка генов.

В том же году группой Корани впервые осуществлен хими­ческий синтез расшифрованного гена аланиновой тРНК дрож­жей, но функционально не активный; позднее и активный ген супрессорный тирозиновой тРНК, галактозного оперона.

Этому способствовало совершенствование методов опреде­ления первичных структур (секвенирования) нуклеиновых кис­лот, а также белков и других продуктов, кодируемых синтези­рованным геном.

Секвенирование ДНК играет большую роль и в изучении функций генов и генетических систем.

Метод химического синтеза генов и введения их в клетки микроорганизмов обеспечил возможность получения продуцен­тов инсулина человека для лечения больных диабетом, открыл­ся путь для производства продуктов белковой природы.

Широкое распространение нашел метод ферментативного синтеза генов по механизму обратной транскрипции. Не вдава­ясь в его суть, отметим, что он позволяет синтезировать практи­чески любой ген в присутствии соответствующих иРНК, мето­ды выделения которых достаточно хорошо разработаны.

С его помощью созданы и клонированы в бактериях гены, кодирующие глобины человека, животных, птиц и т. п., интер­ферон человека, который используют для борьбы с вирусными инфекциями, злокачественными опухолями и рядом других за­болеваний.

Однако остается нерешенной проблема стабильности гиб­ридных молекул. Вектор должен обеспечивать стабильное на­следование рекомбинантных ДНК в автономном, реже интег­рированном с хромосомой состоянии, иметь генетические мар­керы для обнаружения трансформированных клеток, содержать сайт узнавания и др. Он используется для получения банка ге­нов, так как клонированные в них большие фрагменты ДНК лег­ко хранить, выделять и анализировать. Создаются специальные векторы и для клонирования рекомбинантных ДНК в клетках животных и растений, при этом в клетках животных ими могут быть некоторые вирусы, а растений — агробактерии на основе специальных плазмид и передаваться клеткам в естественных условиях бактериями.

Схема, используемая в генной инженерии, едина:

1. Обработка кольцевой векторной молекулы рестриктазой с образованием линейной формы ДНК.

2. Формирование гибридной структуры путем слияния ее с фрагментом чужеродной ДНК.

3. Введение гибрида в клетку реципиента.

4. Отбор клонов трансформированных клеток на селектив­ных средах.

5. Доказательство присутствия рекомбинантной ДНК в этих клонах путем ее выделения из клеток, обработки соответству­ющими рестриктазами и анализа образовавшихся фрагментов методом электрофореза.

Известно несколько методов объединения фрагментов ДНК из разных источников, позволяющих включить клонируемую донорную ДНК в состав вектора.

Одним из перспективных методов клеточной инженерии в культуре клеток человека, животного и растения является гиб­ридизация соматических клеток (Б. Эфрусси и Г. Барски).

В культивируемые клетки млекопитающих или развивающи­еся эмбрионы ДНК вводят методом микроинъекции ДНК в ядро с помощью микроманипулятора.

Развитие методов микрохирургии клеток позволило заменять ядра оплодотворенных яйцеклеток на ядра из соматических кле­ток и в результате получать организм, идентичный тому, чье ядро было перенесено в яйцеклетку.

Создание гибридов высших растений возможно путем слия­ния протопластов и соматической гибридизации растительных клеток.

Все эти методы могут использоваться для конструирования новых форм микроорганизмов, животных и растений, несу­щих гены, детерминирующие желаемые признаки.

Не менее важна генная инженерия как аппарат фундамен­тальных исследований.

Потенциальные возможности генной инженерии в действи­тельности очень велики, и они будут реализовываться.

3. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

Эмбриогенез — это феноменальный процесс, при котором информация, заложенная в линейной структуре ДНК, реализу­ется в трехмерный организм.

ДНК представляет запись после­довательности аминокислот для построения молекул различных белков. В эмбриональном развитии в разное время появляются разные белки. Существуют гены-регуляторы, которые опреде­ляют время и скорость синтеза. Установлены состав и структу­ра гена, но неизвестно как кодируется форма организма и, соот­ветственно, как линейные спирали цепочной структуры белков соединяются в объемные структуры.

Клонирование есть воспроизведение живого существа из его неполовых клеток. Это попытка прорыва сквозь запреты При­роды.

Клонирование органов и тканей — это задача номер один в области трансплантологии, травматологии и др. областях меди­цины и биологии.

При пересадке клонированных органов не возникает реакции отторжения и возможных последствий (например, рака, развивающегося на фоне иммунодефицита). Кло­нированные органы — это спасение для людей, попавших в авто­мобильные аварии или иные катастрофы, а также нуждающихся в радикальной помощи из-за каких-либо заболеваний.