СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Опиоидные пептиды и физиолого-биохимические аспекты их действия

1.2. Обмен регуляторных пептидов

1.2.1. Биогенез нейропептидов

1.2.2. Механизмы регуляции активности ферментов обмена нейропептидов

1.3. Опиоидные пептиды при воздействии стрессорных факторов

1.4. Ферменты обмена нейропептидов при стрессе

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Схема введения предшественника лей-энкефалина

2.2.2. Моделирование острого эмоционально-болевого стресса

2.2.3. Метод определения активности карбоксипептидазы Н

2.2.4. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы

2.2.5. Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента

2.2.6. Методы определения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ in vitro

2.2.7. Метод определения белка по Лоури

2.2.8. Статистическая обработка результатов исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Региональное и тканевое распределение КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ у самцов крыс

3.1.1. Распределение активности КПН

3.1.2. Распределение активности АПФ

3.1.3. Распределение активности ФМСФ-ингибируемой КП

3.2. Исследование влияния острого эмоционально-болевого стресса на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы и АПФ

3.2.1. Активность КПН в головном мозге надпочечниках и семенни-ках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса

3.2.2. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в головном мозге надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса

3.2.3 Активность АПФ в головном мозге надпочечниках и семенниках крыс при воздействии острого эмоционально-болевого стресса

3.3. Исследование влияния предшественника лей-энкефалина на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ

3.3.1. Активность КПН в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-арг

3.3.2. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалинарг

3.3.3. Активность АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс при введении лей-энкефалин-арг

3.4. Исследование влияния лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ in vitro

3.5. Исследование влияние лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы и АПФ у крыс на фоне острого эмоционально-болевого стресса

3.5.1. Активность КПН при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стресса

3.5.2. Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стресса

3.5.3. Активность АПФ при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого эмоционально-болевого стресса

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АПФ- ангиотензинпревращающий фермент

ГГНС- гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система

ГГБ- гисто-гематический барьер

ГЭБ- гемато-энцефалический барьер

ГЭМЯК - гуанидилэтилмеркаптоянтарная кислота

КП - карбоксипептидаза

КПН - карбоксипептидаза Н

ПВДС (ДСИП) - пептид, вызывающий дельта сон (дельта-сон инду-

цирующий пептид)

САС- симпато- адреналовая система

ФМСФ- фенилметилсульфонилфторид

ЭБС- эмоционально-болевой стресс

ВВЕДЕНИЕ.

Одной из наиболее актуальных проблем современной биологии и медицины является исследование влияния острых стресс-факторов на организм. Особый интерес вызывает изучение молекулярных механизмов возникновения и развития стресса. Известно, что кратковременное острое стрессирование приводит к экстренной и генерализованной активации ряда физиологических систем, участвующих как в процессах развития (стресс-реализующие), так и в процессах торможения (стресс-лимитирующие) стресс-реакции [4, 5, 21, 29, 33, 116, 121, 125, 144, 145]. Ведущая роль в регуляции функций этих систем принадлежит нейропептидам, веществам, выступающим в организме в роли нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов [126, 134, 204, 221, 258]. В ответ на стресс в первую очередь вовлекаются пептиды гипофиза: адренокортикотропин (АКТГ), b-эндорфин, пролактин [136]. Важную роль в адаптации организма к стрессу играют эндогенные биологически активные пептиды - компоненты стресс-лимитирующих систем: вещество Р, пептид, вызывающий дельта сон, энкефалины [27, 28, 69, 107, 110, 135, 152, 241]. Одной из наиболее универсальных стресс-лимитирующих систем, обеспечивающих адаптацию к изменениям, вызванным реакцией на действие экстремального фактора, является система эндогенных опиоидных пептидов [14, 103, 104, 116, 125, 266]. Выраженным антистрессорным действием обладают, в частности, энкефалины [23, 69, 134, 140, 266]. Установлено, что при воздействии стресса содержание опиоидов в структурах мозга, крови и ликворе животных увеличивается [33, 34, 140, 243].

Уровень биологически активных пептидов, а, следовательно, и степень реализации ответной реакции физиологических и биохимических систем на воздействие стресс-фактора в значительной мере определяется активностью пептидгидролаз – ферментов, участвующих в образовании и/или деградации молекул регуляторных пептидов [20, 40, 71, 193, 209, 212, 218, 241, 256, 262].

Нейропептиды синтезируются в организме в виде неактивных высокомолекулярных предшественников. На заключительных этапах процессинга регуляторных пептидов, приводящих к образованию их активных форм, принимают участие карбоксипептидазо-Б-подобные ферменты, катализирующие отщепление остатков основных аминокислот - аргинина и лизина - с С-конца предшественников биологически активных пептидов [39, 188, 192, 264, 268]. Одним из основных ферментов генеза таких нейропептидов как энкефалины, вещество Р, АКТГ, окситоцин, вазопрессин является карбоксипептидаза Н (КПН) (Кф 3.4.17.10) [39, 40, 63, 68, 192, 264]. Недавно появились сведения об участии в обмене регуляторных пептидов фермента, активность которого ингибируется фенилметилсульфонил-фторидом - ФМСФ-ингибируемой КП [49, 53]. Данный фермент обладает сходной с КПН субстратной специфичностью, что же касается биологической роли фермента, то этот вопрос до сих пор остается открытым. Известно, что уровень активных форм энкефалинов и других нейропептидов в организме контролируется также ангиотензинпревращающим ферментом (АПФ) (Кф 3.4.15.1), участвующим как в процессинге, так и в деградации регуляторных пептидов [66, 180, 183, 196, 209, 259]. Однако, несмотря на столь важную роль этих ферментов в организме, многие аспекты проявления их функциональной активности изучены недостаточно. Практически отсутствуют сведения об эндогенных механизмах регуляции активности этих ферментов, а также их свойствах при различных патологических и функциональных состояниях организма.