Антифризные белки обладают способностью тормозить образование льда. Для того, чтобы объяснять их роль в данном процессе, были проведены определение их концентрации и иммунолокализация этих белков в листьях, побегах и корнях озимой ржи. Каждый из общих растворимых белков, экстрагированных из акклиматизированных к холоду ржаных листьев, стебле и корне, обладал антифризной активностью, в то время как отсутствие антифризной активности наблюдалась в экстрактах из неакклиматизированных растений ржи. Антитела, полученные против трех апопластных антифризных белков из ржи, соответствующих глюконазоподобному белку, хитиназоподобному белку и тауматиноподобному белку, были использованы для обработки тканевых отпечатков. При этом было показано, что антифризные белки локализуются в эпидермисе и в клетках, окружающих межклеточные пространства, у акклиматизированных к холоду растений. Хотя GLP, CLP и TLP присутствовали в неакклиматизированных растениях, они обнаруживались в других местах и не обладали антифризной активностью, что подтверждает, что при низко температуре производятся другие изоформы связанных с патогенезом белков. Локализация антифризных белков у ржи может предотвращать вторичное повреждение клеток эпифипическим льдом или льдом, распространяющимся через ксилему. Распространение белков, связанных с патогенезом, и белков GLP, CLP, и TLP, накапливающихся под действием холода, аналогично и может отражать общие пути, которыми как патогены, так и лед входят и распространяются по тканям растения.

Синтетически ген антифризного белка экспрессировался в растениях и, как показали результаты экспериментов, снижал утечку электролита из листьев при температуре замерзания почвы. Синтетически антифризны белок экспрессировался в качестве слитого с сигнальным пептидом, направляющим его к межклеточному пространству, где вначале проявляется кристаллизация льда. Ген был введен в Solanum tuberosum L. Cv. Russet Burbank при помощи Agrobacterium-опосредованной трансформации. Трансформанты идентифицировались при помощи PCR – скрининга и экспрессия введенного белка проверялась иммуноблоттингом. Анализ высвобождения электролитов из листьев трансгенных растений выявил корреляцию между уровнем экспрессии трансгенного белка и степенью выносливости к замерзанию почвы.

Применение методик, основанных на изучении рекристаллизации льда, позволило в последнее время установить в ряде видов растений наличие белков, обладающих антифризной активностью. В частности в корне акклиматизированной к холоду моркови был выделен и идентифицирован новы индуцируемы холодом антифризный белок с молекулярной массой 36 кДа. В ходе изучения его свойств было установлено, что этот белок подавляет рекристаллизацию льда и обладает термогистерезисной активностью.

Показано, что этот полипептид существует в растворе в виде N-гликозилированного мономера. Белок, так же как и остальные известные антифризные белки, локализован в апопласте. Соответствующий этому белку ген, как показали результаты исследований, является уникальным и индуцируется холодом.

Регулируемые холодом белки

Во время холодовой акклиматизации Arabidopsis thaliana синтезируются различные регулируемые холодом полипептиды, которые не имеют или имеют очень небольшое сходство с другими известными белками. Регулируемые холодом гены cor15а и cor6.6 кодируют, соответственно, 15 и 6.6 кДа полипептиды. Известно, что полипептид COR15а транспортируется в хлоропласты и во время импорта процессируется в 9.4 кДа полипептид, обозначенный как COR15ам. Полипептид COR6.6, как считается, локализуется в цитозоле. Кодирующие последовательности ш5ам и cor6.6 были перенесены под промотор фага Т7 и экспрессированы в E. coli. Рекомбинантные полипептиды COR15аm и COR6.6 были очищены до почти гомогенного состояния с использованием комбинации фракционирования сульфатом аммония, ионообменной хроматографии и адсорбционной хроматографии на гидроксиапатите. COR15аm и большинство образцов COR15аm совместно мигрировали как на двумерном электрофорезе по O'Farrell, так и на неденатурирующем электрофорезе. Эти данные подтверждают место процессинга COR15а и показывают отсутствие различий в четвертичной структуре между COR15аm и большинством видов COR15аm в растениях. Напротив, миграция пятен COR6.6 и COR6.6 на двумерных гелях показывает, что значительная часть популяции COR6.6 в растениях модифицируется. При дальнейшем исследовании этих двух белков были определены их гидратационные характеристики и их действие на переходы смеси фосфолипидов из жидкокристаллического в гелеобразное состояние и из ламеллярной фазы в гексагональную II фазу. После обезвоживания при осмотическом давлении от 8 до 150 МПа содержание воды в COR – полипептидах было меньше, чем в БСА, причем COR15ам был гидратирован меньше, чем COR6.6. Ни COR6.6, ни COR15ам не изменяли температуру вызванного дегидратацией перехода как дипальмитоилфосфатидилхолина, так и диолеилфосфатидилхолина из гелеобразного в жидкокристаллическое состояние. В мультиламеллярных везикулах, состоящих из смеси дипальмитоилфосфатидилхолин, ни COR15ам, ни COR6.6, ни БСА не влияли на вызванное обезвоживанием образование инвертированной гексагональной фазы как на функцию осмотического давления. Тем не менее, в смеси дипальмитоилфосфатидилхолин, дегидратировавшейся в присутствии COR15аm, наблюдалось специфическое ультраструктурное изменение – образование определенно поверхностно морфологии в ламеллярных доменах. Тем не менее, ни COR15ам, ни COR6.6, по-видимому, не участвуют в специфическом белково-фосфолипидном взаимодействии, изменяющим вызванное дегидратацией состояние фаз фосфолипидных везикул. Было проверено, действуют ли COR15ам и COR6.6 на индуцируемое холодом слияние или целостность мембран небольших униламеллярных везикул, состоящих как из различных видов фосфатидилхолина, так и из смеси диолеилфосфатидилхолина, диолеилфосфатидилэтаноламина и свободных стеролов, а также на общи липидны экстракт плазматических мембран как неакклиматизированных, так и акклиматизированных к холоду листьев риса. Когда везикулы были суспендированы в буферном растворе, как COR15ам, так и COR6.6 значительно уменьшали вызванное замораживанием слияние вне зависимости от их липидного состава. В то же время, когда везикулы были суспендированы в сахарозе или в среде, содержащей NaCl, COR-белки не оказывали влияние на индуцируемое холодом слияние. Более того, COR-белки не оказывали влияние на уменьшение вызванных холодом утечек, были ли везикулы суспендированы в чистом буфере либо в буфере с добавками NaCl или сахарозы. Фактически, действие COR-белков на везикулы, составленные из отдельных видов фосфатидилхолина, суспендированных в буфере, выражалось в аномальном увеличении вызванных замораживанием утечек. Таким образом, было установлено, что ни COR15ам, ни COR6.6 не имеют прямого криопротекторного действия на везикулы, замороженные in vitro.

Многие растения, в том числе Arabidopsis, увеличивают устойчивость к замораживанию после воздействия низких незамораживающих