Эффект множественного мечения определяется способом получения дейтерированных молекул и свидетельствует о недостаточно высокой селективности биосинтетической схемы, повысить которую возможно контролем изотопного состава синтетической ростовой среды и исключения источников дополнительных протонов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исследования проводили с генетически маркированным штаммом грамположительных бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3157, продуцентом инозина, адаптированным к дейтерию рассевом до отдельных колоний на 2% агаре с 2Н2О и последующей селекции по признаку устойчивости к 2Н2О.

В работе использовали 2Н2О (99.9 ат.% 2Н), 2НСl (95.5 ат.% 2Н) и [U-2H]метанол (97.5 ат.% 2Н) (ЗАО Изотоп, Санкт-Петербург, РФ). Неорганические соли и D, L- глюкозу (Reanal, Венгрия) предварительно перекристаллизовывали в 2Н2О, 2H2O дистиллировали над перманганатом калия с последующим контролем изотопной чистоты 1Н ЯМР-спектроскопией на приборе Brucker WM-250 (ФРГ) (Частота 70 МГц). Масс-спектры электронного удара ЭУ получены на приборе МB-80A (Hitachi, Япония) с двойным фокусированием (энергия ионизирующих электронов 70 эВ, ускоряющее напряжение 8 кВ, температура катодного источника 180-2000С) после модификации в метиловые эфиры N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных производных аминокислот по разработанной раннее методике [7]. Масс-спектры FAB получены на импульсном масс-спектрометре VG-70 SEQ (Fisons, VG Analitical, США), снабженным цезиевым источником Cs+ на глицериновой матрице с ускоряющем напряжением 5 кВ и ионным током 0.6-0.8 мА. УФ-спектры регистрировали на программируемом спектрофотометре Beckman DU-6 (США) в диапазоне длин волн 220-280 нм. Центрифугирование осуществляли на центрифуге Т-24 (ФРГ) с охлаждением при -40С. Аналитическую обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Gilson (ФРГ) и рефрактометром Waters K-401 (ФРГ) на колонке Separon С18 (250 x 10 мм), элюция смесью ацетонитрил : вода, 75 : 25, об.%, скорость элюирования 0.6 мл/мин. Ионообменную хроматографию осуществляли на катионообменной колонке Biotronic LC-5001 (ФРГ) (230 x 3.2) с сульфированной стирольной (7.25% сшивки) смолой UR-30 (Beckman-Spinco, США); рабочее давление 50-60 атм; скорость подачи Na+-цитратного буфера 18.5; нингидрина 9.25 мл/ч; детекция при 570 нм. Уровень биоконверсии углеродного субстрата определяли, используя глюкозооксидазу (КФ 1.1.3.4) как описано в работе [35].

Биосинтетический 2Н-меченый инозин. Получен с выходом 3.9 г/л на синтетической тяжеловодородной среде (89-90% ат. 2Н), используя в качестве источника 2Н-меченых ростовых субстратов гидролизат биомассы метанол-ассимилирующего штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum ВКПМ B-5662 (условия получения: автоклавирование в 0.1 н. 2НСl 30-40 мин при 08 ати), выделенный скринингом в условиях многостадийной адаптации на твердой среде М9 (2% агар) с 2% [U-2Н]метанолом со ступенчато увеличивающимся градиентом концентрации тяжелой воды (от 0 до 98% 2Н2О). Состав синтетической тяжеловодородной среды (мас.%): глюкоза - 12; 2Н-меченый гидролизат B. methylicum - 2; NH4NO3 - 2; MgSO4 . 7H2O - 1; Са2СО3 - 2. Синтез проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл (наполнение средой 100 мл) в течение 5-6 сут при 30-320С в условиях интенсивной аэрации реакционной смеси на орбитальном шейкере S-380 (Венгрия).

Очистка 2Н-меченого инозина. Пробы КЖ центрифугировали при 2000 g, 10 мин, концентрировали при 10 мм рт. ст., добавляли ацетон при 00С (3 x 5 мл). Смесь выдерживали 14-15 ч при -40С, осадок отделяли центрифугированием при 1200 g, 5 мин. К супернатанту добавляли 10 г активированного угля, выдерживали 2 сут при 40С. Водную фракцию отделяли фильтрованием, к твердой фазе добавляли 20 мл 50% этанола в 25% аммиаке (1 : 1, об.%), кипятили при 600С с обратным водяным холодильником. Через 2-3 ч смесь фильтровали и упаривали при 10 мм рт. ст. Продукт экстрагировали 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН 8.9), промывали ацетоном (2 x 10 мл), сушили над безводным СaCl2. Инозин перекристаллизовывали из 80% этанола, очищали методом ионообменной хроматографии на откалиброванной колонке Biorad (150 x 10 мм) с катионообменной смолой АG50WX 4 (Pharmacia, США), уравновешенной 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН 8.9) c 0.045 М NH4Cl в условиях изократической элюции (хроматографическая чистота 92%). Контроль чистоты проводили методом ТСХ с использованием стандартного набора рибонуклеозидов фирмы Beckman-Spinco (США) на хроматографических пластинках (150 x 150 мм) с закрепленным слоем флуоресцентного носителя Silufol UV-254 (Чехословакия) в системе растворителей: H-бутанол : уксусная кислота : вода, 2 : 1 : 1, об.%. Выход 2.5 г/л (64%). Т. пл. 68-700С. [a]D20 1.610 (с 1.5 этанол). Rf 0.5. рКa 1.2 (фосфатный буфер, рН 6.87). УФ-спектр(0.1 н. НСl) (lmax 249 нм, e249 7100 М-1 см-1); FAB-спектр (глицериновая матрица Cs+, ускоряющее напряжение 5 кВ, ионный ток 0.6-0.8 мА): (M+H)+ m/z (I,%): 273, 20% (4 ат. 2Н); 274, 38% (5 ат. 2Н); 275, 28% (6 ат. 2Н); 276, 14% (7 ат. 2Н), (А + H)+ 136, 46%; (Б + Н)+ 138, 55%; (Б - НCN)+ 111, 49%; (В - HCN)+ 84, 43%.