Применение в определенной последовательности ряда перечисленных методов позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный, однако, некоторых примесей солей. Для полного освобождения белков от низкомолекулярных примесей в настоящее время используют методы диализа, гельхроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации.

При диализе применяют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка) , диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомолекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.

Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при медленном повышении температуры. Уже получены сотни кристаллических белков. Однако не всякий кристаллический белок является гомогенным, поскольку при одной и той же концентрации раствора сульфата аммония могут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разные белки.

Наилучшие результаты при освобождении белков от низкомолекулярных примесей получают с помощью гельхроматографии и ультрафильтрации. Последняя основана на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их.

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или других в-в.

Кинетика ферментативной реакции-т. е зависимость скорости реакции от ее условий, определяется в первую очередь свойствами катализатора.

Модель Михаэлиса-Ментена.

Исходит из того, что вначале субстрат А образует с ферментомЕ комплекс, который превращается в продукт В, намного быстрее, чем в отсутствии фермента.

Константа скорости каталитической реакции соответствует числу молекул субстрата, превратившихся в продукт одной молекулой фермента за 1 сек.

Активность фермента:

[ЕА]/[Е]t=[А]+Км[А],

где[Е]t-общая концентрация фермента

V=Ккат. [ЕА]

V=Ккат. *[Е]t*[А]/Км+[А], [М/с]

-уравнение Мехаэлиса-Ментена.

Уравнение содержит два параметра, которые не зависят от концентрации субстрата[А], но характеризуют свойства фермента.

1) Vмах. =Ккат. *[Е]t-

характеризует эффективность катализа

2) Км-константа Михаэлиса

Км=[А] при V=Vмах/2 Км=[Е]*[А]/ [ЕА],

характеризует сродство фермента к субстрату.

Высокое сродство к субстрату характеризуется низкой величиной Км и наоборот.

Все это осуществляется при определенных условиях (допущениях) :

-необратимое превращение ЕА в Е+В

-достижение равновесия м/д Е, А и ЕА

-отсутствие в растроре других форм фермента, кроме ЕА и Е

6. Механизмы окислительного и субстратного фосфорилирования

Примером субстратного фосфорелирования можно считать второй этап гликолиза. Фермент дегидрогиназа ФГА образует с 3-ФГА фермент-субстратный комплекс, с которым происходит окисление субстарта и передача электронов и протонов на НАД. В ходе окисления ФГА до ФГК в фермент-субстратном комплексе возникает высокоэнергетическая связь) т. е. связь с очень высокой свободной энергией гидролиза). Далее осуществляется фосфоролиз этой связи, в результате чего SН-фермент отщепляется от субстрата, а к остатку карбоксильной группы субстрата присоединяется неорганический фосфат, причем связь сохраняет значительный запас энергии, освободившийся в результате окисления 3-ФГА. Высокоэнергетическая фосфатная группа передается на АДР и образуется АТФ. Так каа в данном случае высокоэнергетическая ковалентная связь фосфата формируется прямо на окисляемом субстрате, такой процесс-субстратное фосфорелирование.

Процесс фосфорелирования АДР с образованием АТФ, сопряженный с переносом электронов по транспортной цепи митохондрий получил название окислительного. По поводу механизма окислительного фосфорелирования существует 3 теории:химическая, механохимическая и хемиосмотическая.

Согласно химической гипотезы в митохондриях имеются интермедиаторы белковой природы образующие комплексы с соответствующими восстановленными переносчиками. В результате окисления переносчика в комплексе возникает высокоэнергетическая связь. При распаде комплекса к интермедиатору с высокоэнергетической связью присоединяется неорганический фосфат, который затем передается на АДР.

Способность митохондриальных мембран к конформационным изменениям и связь этих изменений со степенью энергизаци митохондрий послужила основой для создания механохимических гипотез образования АТФ в ходе окислительного фосфорелирования. Согласно этим гипотезам энергия, высвобождающаяся в процессе переноса электронов непосредственно использующихся для перевода белков внутренней мембраны митохондрий в новое, богатое энергией конформационное состояние, приводящее к образованию АТФ. Таким образом, согласно механохимическим гипотезам, энергия окисления, превращается сначало в механическую энергию, а затем в энергию АТФ.

Хемиосмотическая теория сопряжения. Митчел высказал предположение, что поток электронов через систему молекул переносчиков сопровождается трансортом ионов Н через внутреннюю мембрану митохондрий. В результате на мембране создается электроно-химический потенциал ионов Н, включающий химический или осмотический градиент и электрохимический градиент. Согласно хемиосмотической теории электрохимический трансмембранный потенциал ионов Н и является источником энергии для синтеза АТФ за счет обращения транспорта ионов Н через протонный канал мембранной Н-АТФазы.

7. Способы разделения и очистки органических веществ

Для установления состава органического вещества прежде всего необходимо получить его в достаточно чистом состоянии. В зависимости от агрегатного состояния вещества (твердое, жидкое, газообразное) применяют различные методы очистки.

Твердые вещества могут быть освобождены от содержащихся в них примесей путем перекристаллизации. В этом случае стремятся найти растворитель, растворимость в котором очищаемого вещества значительно отличается от растворимости содержащихся в нем примесей. Если трудно растворимо очищаемое вещество, то оно выкристаллизовывается в чистом виде при охлаждении горячего насыщенного раствора, в то время как примеси остаются в маточном растворе. Если трудно растворимы примеси, то выкристаллизовываются они, а основное вещество остается в растворе. В ряде случаев вещество достаточной степени чистоты может быть получено только в результате многократной перекристаллизации, причем зачастую лучшие результаты получаются при чередовании различных растворителей. Иногда вещество содержит высокомолекулярные или коллоидные окрашенные примеси, которые не могут быть отделены обычной перекристаллизацией. Тогда вещество освобождают от примесей кипячением растворов с адсорбирующими агентами, например с активированным углем.