В 60-е гг. в химии белков развивалось синтетическое направление: были синтезированы инсулин и рибонуклеаза. Дальнейшее развитие получили аналитические методы: стал широко использоваться автоматический аминокислотный анализатор, созданный С. Муром и У. Стайном в 1958, существенно модифицированы хроматографические методы, до высокой степени совершенства доведен рентгеноструктурный анализ, сконструирован автоматический прибор для определения последовательности аминокислотных остатков в белке – секвенатор. Благодаря созданию прочной методологической базы стало возможным проводить широкие исследования аминокислотной последовательности белка. В эти годы была определена структура несколько сотен сравнительно небольших белков (до 300 аминокислотных остатков в одной цепи), полученных из самых различных источников как животного, так и растительного, бактериального, вирусного и другого происхождения. Среди них – протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, субтилизин, карбоксипептидазы), миоглобины, геомоглобины, цитохромы, лизоцимы, иммуноглобулины, гистоны, нейротоксины, белкоавых оболочек вирусов, белково-пептидные гормоны и др. В результате были созданы предпосылки для решения актуальных проблем энзимологии, иммунологии, эндокринологии и др. областей физико-химической биологии.

В 70-80-е гг. наибольший прогресс был достигнут при изучении белков-регуляторов матричного синтеза биополимеров (в т.ч. белков рибосом), сократительных, транспортных и защитных белков, ряда мембранных белков (в т.ч. белков биоэнергетических систем), рецепторных белков. Большое внимание уделялось дальнейшему совершенствованию методов анализа белка. Значительно повышена чувствительность автоматического анализа аминокислотной последовательности б. Широкое применение нашли новые методы разделения белков и пептидов (жидкостная хроматография высокого давления, биоспецифическая хроматография). В связи с разработкой эффективных методов анализа нуклеотидной последовательности ДНК (А. Максам и У. Гилберт, Ф. Сингер) стало возможным использовать полученную при таком анализе информацию и при определении первичной структуры белков. В результате установлена структура ряда белков, доступных в ничтожно малых количествах (интерферон, ацетилхолиновый рецептор), а также белков, большой молекулярной массы. Успехи структурного анализа позволили вплотную приступить к определению пространственной организации и молекулярных механизмов функционирования надмолекулярных комплексов, в т.ч. рибосом, хроматина (нуклеосом), митохондрий, фагов и вирусов. Существенные результаты получены в эти годы советскими учеными: определена первичная структура аспартатаминотрансферазы (1972), бактериородопсина (1978), животного родопсина (1982), некоторых рибосомальных белков, фактора элонгации G (1982), важнейшего фермента – РНК-полимеразы (1976-82), нейротоксинов и др.

2. Свойства белка, выделение

Свойства. Физическо-химические свойства белков определяются их высокомолекулярной природой, компактность укладки полипептидных цепей и взаимным расположением остатков аминокислот. Молекулярная масса варьируется от 5 до 1 млн., а константы седиментации – от 1 до 20 (и выше). Средний удельный объем белковых молекул –0,70-0,75 см3/г, а константы диффузии – 106-108 см2/с. Максимум поглощения белков, в УФ-области спектра, обусловленный наличием ароматических аминокислот, находится вблизи 280 нм. Возбуждение электронов атома азота пептидной группы вызывает резкое увеличение поглощения при 185-240 нм. В ИК-области спектра белки поглощают за счет СО- и NH-групп при 1600 и 3100-3300 см-1.

В растворах белки амфотерны. Изоэлектрические точки белка могут иметь значения от <1,0 (у пепсина) до 10,6 (у цитохрома с) и выше. Боковые группы аминокислотных остатков способны вступать во многие реакции. Белки дают ряд цветных реакций, обусловленных наличием определенных аминокислотных остатков или химических группировок. К важнейшим из них относятся: биуретовая реакция (пептидные связи), ксантопротеиновая реакция (ароматические ядра остатков тирозина, триптофана, фенилаланина), Адамкевича реакция (индольное кольцо триптофана), Миллона реакция (фенольный радикал тирозина), Паули реакция (имидазольное кольцо гистидина), Сакагучи реакция (гуанидиновая группа аргинина) и нингидриновая реакция (аминограппа).

Выделение. Один из первых этапов выделения белка – получение соответствующих органелл (рибосом, митохондрий, ядер, цитоплазматической мембраны) с помощью дифференциального центрифугирования. Далее белки переводят в растворимое состояние путем экстракции буферными растворами солей и детергентов, иногда – неполярными растворителями. Затем применяют фракционное осаждение неорганическими солями, этанолом, ацетоном или путем изменения pH, ионной силы. Для предотвращения денатурации работу проводят при пониженной температуре, с целью исключения протеолиза используют ингибиторы протеаз, некоторые белки стабилизируют полиолами, например глицерином. Дальнейшую очистку проводят по схемам, специально разработанным для отдельных белков или группы гомологичных белков. Наиболее распространенные методы разделения – гель-проникающая хроматография, ионообменная и адсобрционная хроматография; эффективные методы – жидкостная хроматография высокого разрешения и аффинная хроматография.

Критерий чистоты критерий чистоты белка – гомогенность при электрофорезе, хроматографии и ультрацентрифугировании. Одноцепочечный белок должен быть гомогенным при N- и C-концевом анализе. Примесь сопутствующих ферментов определяют с помощью специфических субстратов; высокую чувствительность имеют иммунохимические методы (обычно до 10-3 мкг/мл примесного антигена).

3. Синтез белка

Биосинтез белка происходит в результате трансляции в субклеточных частицах – рибосомах, представляющих собой сложный рибонуклеиновый комплекс. Информация о первичной структуре белка «хранится» в соответствующих генах – участках ДНК – в виде последовательности нуклеотидов. В процесс транскрипции эта информация с помощью фермента – ДНК – зависимой РНК – полимеразы – передается на матричную рибонуклеиновую кислоту, которая, соединяясь с рибосомой, служит матрицей для синтеза белка. Выходящие из рибосомы синтезированные полипептидные цепи, самопроизвольно сворачиваясь, принимают присущую данному белку конформацию, а также подвергаются модификации благодаря реакциям различных функциональных групп аминокислотных остатков и расщеплению пептидных связей.

Химический синтез широко применяют для получения пептидов, в т.ч. биологически активных гормонов и их разнообразных аналогов, используемых для изучения взаимосвязи структуры и биологической функции, а также пептидов, несущих антигенные детерминанты различных белков и применяемых для приготовления соответствующих вакцин. Первые химические синтезы белка в 60-е гг. (инсулина овцы и рибонуклеазы S), осуществленные в растворе с помощью тех же методов, которые используют при синтезе пептидов, были связаны с чрезвычайно большими сложностями. В каждом случае требовалось провести сотни химических реакций и окончательный выход белка был очень низок (менее 0,1%), в результате чего полученные препараты не удалось очистить. Позже были синтезированы некоторые химически чистые белки, в частности инсулин человека (П. Зибер и др.) и нейротоксин II из ядра среднеазиатской кобры (В.Т. Иванов). Однако до сих пор химический синтез белка представляет весьма сложную проблему и имеет скорее теоретическое, чем практическое значение. Более перспективны методы генетической инженерии, которые позволяют наладить промышленное получение практически важных белков и пептидов.