2.5 Статистическая обработка результатов

Статистический анализ осуществлялся с помощью программы Statistica 7 с использованием t-критерия Стьюдента.

Различие считалось достоверным при уровне значимости Р<0,05.

Все исследования выполнены в лаборатории функциональной биохимии нервной системы института Высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

Автор выражает глубокую благодарность за оказанную всестороннюю помощь при выполнении работы сотрудникам лаборатории функциональной биохимии нервной системы института Высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, отдельно к.б.н. Онуфриеву Н.В. и д.б.н., профессору Гуляевой Н.В.

Глава 3. Полученные результаты и их обсуждение

Экспрессия белков клеточного цикла и Cdk 5 имеет различный уровень в исследованных отделах мозга и зависит от функционального состояния сусликов.

Гибернация достоверно снижает в гиппокампе уровень экспрессии Cdc 2, Cdk 2 и Cdk 4, а экспрессия MCM 2 и Cdk 5 имеет лишь тенденции к снижению по сравнению с контролем (активные животные) (рис.2) . Экспрессия циклинов. А и В1 остаётся практически на том же уровне, что и у активных сусликов. У спонтанно пробудившихся животных уровень экспрессии исследуемых белков также существенно не изменялся по сравнению с контролем. Однако на стадии пробуждения при температуре + 25°С была выявлена положительная корреляция между циклином В1 и МСМ 2 (r = 0,97 ,p < 0,05). Возможно, на стадии пробуждения при температуре + 25°С образование МСМ 2 идет однонаправленно с биосинтезом Сn B1 в отличие от пробуждения при температуре + 10°С (известно, что комплекс МСМ 2/МСМ4 является субстратом для комплекса Cdc2/Cn B1 in vitro). МСМ 2 является маркёром репликации ДНК, его уровень возрастает при переходе клетки из фазы G1 в S фазу клеточного цикла. А циклин В1 активируется в конце фазы G2, образуя комплекс с Cdc 2, небходимый для начала последней стадии цикла – М фазы (собственно митоза).

Рис. 2 Экспрессия исследуемых белков в гиппокампе сусликов CITELLUS UNDULATUS на разных стадиях гибернационного цикла

Отличия от группы контрольных животных: * - p < 0,05; # - p < 0,1.

В коре больших полушарий мозга на экспрессию белков влияла температура окружающей среды, при которой животные находились на стадиях вхождения в спячку и выхода из неё (рис. 3). Достоверными являются различия уровня экспрессии Cdk 5 и Cdk 4 внутри групп вхождения и выхода из спячки; Cdc 2 и MCM 2 – внутри группы входа из спячки; циклина В1 – внутри группы вхождения в спячку. Так,по сравнению с контрольной группой животных на стадии пробуждения при +10°С достоверно возрастал уровень экспрессии Cdc 2, MCM 2 и Cdk 4 . При +25°С достоверно снижалась экспрессия Cdk 4; на уровне тенденций экспрессия Cdc 2 снижалась, а циклина В1 и MCM 2 - повышалась. При вхождении в спячку при +10°С достоверно возрастала экспрессия MCM 2 и Cdk 4,снижалась экспрессия Cdk 5 ; а при + 36°С на уровне тенденций изменялась только экспрессия Cdk 4 (уменьшалась).

У спящих животных по сравнению с контрольной группой различий в экспрессии исследуемых белков не наблюдалось. В межбаутный период достоверно уменьшалась экспрессия циклина В1 и увеличивалась экспрессия Cdk 4, экспрессия Cdk 5 имела тенденцию к снижению. В межбаутный период была выявлена отрицательная корреляция между Cdk 2 и циклином В1 (r = - 0,98 ,p < 0,05).

Рис. 3 Экспрессия исследуемых белков в коре больших полушарий мозга сусликов CITELLUS UNDULATUS на разных стадиях гибернационного цикла

Отличия от группы контрольных животных: * - p < 0,05; # - p < 0,1.

В мозжечке не наблюдается достоверных различий внутри групп вхождения и выхода из спячки при различных температурных режимах содержания животных (рис. 4). Однако на стадии вхождения в спячку (в сравнении с контролем) наблюдается достоверное увеличение экспрессии Cdk 2 как при + 36°С, так и при + 10°С, а Cdk 4 – только при + 10°С. Экспрессия МСМ2 и циклина А увеличивается на уровне тенденций. Выход из спячки при + 10°С сопровождается достоверным увеличением экспрессии Cdc 2 и Cdk 2 , а Cdk 4 и Cdk 5- увеличением на уровне тенденций. При пробуждении при температуре +25°С тенденции к увеличению экспрессии имеют циклин В1, МСМ2, Cdk 2 , Cdk 4 и Cdk 5.

У спящих животных достоверно снижалась экспрессия только Cdc 2.

Успонтанно пробудившихся животных достоверно возрастала экспрессия только Cdk 4, а количество остальных белков колебалось на уровне контроля.

Положительная корреляция была выявлена между Cdc 2 и циклином В1 (r = 0,97 ,p < 0,05) на стадии вхождения в спячку при температуре + 10°С , отрицательная – на стадии пробуждения при температуре + 25°С между Cdk 2 и циклином А. Наверное различную роль играют Cdc 2 и циклин В1 на стадии вхождения в спячку, когда пролиферация снижается и при пробуждении, когда она более вероятна.

Рис.4 Экспрессия исследуемых белков мозжечке сусликов CITELLUS UNDULATUS на разных стадиях гибернационного цикла

Отличия от группы контрольных животных: * - p < 0,05; # - p < 0,1.

В стволе мозга гибернация не вызывала достоверных изменений в экспрессии исследуемых белков, только уровень МСМ2 имел тенденцию к увеличению.

В межбаутный период экспрессия белков изменялась недостоверно.

Уровень экспрессии циклина А достоверно повышался при вхождении в спячку при температуре +36˚С и при выходе из неё при температуре +25˚С, на уровне тенденции – при пробуждении при температуре +10˚С. Достоверным является различие в экспрессии Cdk 2 в группе выхода из спячки при разных температурных режимах (при температуре +25˚С – уменьшалась, а при +10˚С - увеличивалась ). Различия наблюдаются только внутри группы и отсутствуют при сравнении с активными и межбаутными. Хотя при низкой температуре тела во время выхода выхода из спячки экспрессия некоторых белков в основном повышается!

Отрицательные корреляции были выявлены между Cdk 2 и циклином А (r = -0,99 ,p < 0,05) на стадии пробуждения при температуре +10˚С и между Cdk 2 и циклином В1 при вхождении в спячку при температуре +36˚С.

Рис. 5 Экспрессия исследуемых белков стволе мозга сусликов CITELLUS UNDULATUS на разных стадиях гибернационного цикла

Отличия от группы контрольных животных: * - p < 0,05; # - p < 0,1.

Особенностью метаболизма мозга является интенсивный окислительный обмен. Основным субстратом энергетического метаболизма мозга является глюкоза [ 14 ]. Клетки головного мозга утилизируют 20% кислорода, потребляемого организмом, хотя сам мозг составляет около 2% от массы тела [ 14, 17 ], что обуславливает потенциальную возможность образования большого количества АФК в процессе окислительного фосфорилирования. Это обстоятельство предопределяет потребность мозга в высоком уровне кровоснабжения.