Но тут природа сделала исследователям роскошный подарок. Оказалось, что некий белок из оболочки бактерии Staphylococcus aureus, названный "белком А", способен прочно связываться с неизменной частью ("стержнем") большинства IgG.

За словом "оказалось" скрывается многое. Вряд ли белок с таким свойством специально искали именно у этой бактерии. Скорее всего его обнаружили случайно. (Но, как говорит пословица, ученый тот, кто видит то же, что видят все, но замечает то, что не заметил никто!).

Так или иначе, но обнаружение указанного свойства белка А открыло путь к осуществлению последнего этапа нашей программы. На колонку активированной сефарозы химически прочно сажают белок А (даже есть в продаже готовая "Protein А - Sepharose CL-4В") и через нее в определенных условиях пропускают раствор специфических антител. Они закрепляются на колонке через свои "стержни" и белок А.

Оба конца разветвления остаются свободными. Колонка готова - создан аффинный иммуносорбент для немедленной очистки из любой белковой смеси того белка, который был использован для иммунизации кролика. Снять его с колонки после очистки не представляет труда - кислотой или солью .

Аффинные иммуносорбенты нашли широкое применение и, кстати сказать, не только для очистки белков. В 1978 г. Stumphet сумели этим методом из смеси фрагментов ядерной ДНК отделить гибридные ДНК-РНК куски. По этим гибридам определили гены, ответственные за синтез рибосомальных РНК. (Кролика в этом случае иммунизировали двухнитевым синтетическим гибридом полиадениловой кислоты и полидезоксириботимидиновой кислоты) Оказалось, что такой гибрид отлично имитирует в отношении специализации антител гибрид ДНК-РНК.

Отыскание антигена после электрофореза смеси белков

Это - еще один весьма полезный вариант использования иммуноспецифического связывания антител с их антигенами. Представим себе, что после разделения смеси белков электрофорезом в ПААГ получается большое число белковых полос, из которых одна должна содержать искомый белок.

Здесь можно использовать сочетание избирательности иммуноспецифического связывания с очень чувствительным способом использования радиоактивности. Интересующим исследователя белком иммунизируют кролика и очищают из его крови антисыворотку. Разработана и имеется в продаже специальная, так называемая "диазобумага".

Она обладает способностью по своим активным диазогруппам ковалентной химической связью присоединять любые белки.

По окончании электрофореза с верхней поверхности геля фильтровальной бумагой удаляют избыток влаги и кладут на него диазобумагу, зафиксировав ее положение на геле проколами по двум углам бумаги и геля. Потом эту пару, гелем вниз, помещают в систему "блоттинга", для переноса ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр.

То есть кладут гель на лист толстой фильтровальной бумаги, постоянно смачиваемой буфером, а на диазобумагу накладывают стопку фильтровальной бумаги и через пластинку стекла прижимают грузом. Током жидкости, идущей вверх по капиллярам, часть белков из каждой полосы переносится на диазобумагу и там прочно фиксируется.

Неиспользованные диазогруппы между белковыми "репликами" закрывают вымачиванием в 10% -ном растворе этаноламина, который в отношениях с диазогруппой имитирует белок. Затем диазобумагу помещают в раствор полученной ранее антисыворотки и выдерживают 12 часов при 37°С.

За это время завершается реакция связывания специфических антител, имеющихся в антисыворотке с фиксированным на бумаге антигеном. (Для всех остальных белков в антисыворотке, - даже суммарной, - нет специфических антител) Оставшиеся свободными антитела отмывают буфером.

Наконец, диазобумагу, на которой имеется реплика искомого белка вместе со связавшимися с ним антителами, инкубируют 2 часа при 37°С в растворе меченого радиоактивным йодом белка А (он доступен в виде готового препарата).

Не сорбированный на "стержнях" антител белок А отмывают крепким солевым раствором. Бумагу сушат и методом авторадиографии (описанным в следующей главе) на рентгеновской пленке локализуют положение полосы искомого белка. Для последующего правильного совмещения пленки с диазобумагой (а через нее и с гелем), на бумаге перед авторадиографией делают две пометки радиоактивными чернилами.

Радиоактивные изотопы, используемые в биологии

Явление радиоактивного распада изучается в школьном курсе физики, и потому физическую природу радиоактивности мы здесь рассматривать не будем. Перечислю только те характеристики этого явления, которые существенны для дальнейшего изложения.

1. Известны три вида радиоактивного излучения: а, (3 и у. ос-частицы представляют собой ядра гелия; (З-частицы - это обычные электроны (Р-электроны) и у - очень коротковолновое электромагнитное изучение. В биологии используются только два последних вида.

2. Р-электроны испускаются ядрами атомов и потому химические свойства соответствующих радиоактивных изотопов (их валентности и химические связи) при этом не изменяются.

3. Интенсивность излучения любого радиоактивного препарата уменьшается со временем, поскольку уменьшается число атомов, способных к радиоактивному распаду в смеси с теми, в которых он уже произошел. Скорость этого уменьшения характеризуется так называемым временем полураспада (ТУ).

То есть временем, за которое любое данное количество изотопа (а с ним и интенсивность излучения) уменьшается вдвое. Очевидно, что эта характеристика остается неизменной в течение всего "периода жизни" этого изотопа. Время полураспада для различных изотопов колеблется в очень широких пределах.

Для изотопов, используемых в биологии, - от нескольких суток до нескольких тысяч лет (см. таблицу ниже). Знания величины ТУ очень существенно: в одних случаях даже при длительном хранении радиоактивного препарата интенсивность его излучения практически не изменяется, в других - она может упасть почти до нуля за пару недель.

4. Интенсивность излучения данного радиоактивного препарата в данный момент времени характеризуется числом радиоактивных распадов (актов излучения) в минуту. Его чаще всего выражают в единицах "Кюри" (Ки). Это - очень крупная единица.1Ки==2,2 1012 распадов в минуту.

Другая величина, принятая в системе единиц СИ, оказалась, напротив, слишком мала: 1 Беккерель (Бк) = 1 распаду в секунду. Поэтому до сих пор интенсивность предпочитают выражать числом милликюри (мКи) или микрокюри (мкКи).

5. Практический интерес представляет удельная радиоактивность (УА), т.е. радиоактивность 1 миллимоля радиоактивного вещества, в котором часть атомов уже претерпела радиоактивный распад. Кроме того, в подавляющем большинстве случаев истинно радиоактивные изотопы составляют лишь некоторую долю от общего числа атомов (или молекул) вещества, именуемого радиоактивным. УА выражают в единицах Ки/ммоль или мКи/ммоль.

6. Очень важной характеристикой радиоактивного излучения является энергия вылетающих частиц (у-излучение тоже происходит отдельными порциями энергии - "у-квантами"). И Р-электроны, и у-кванты, испускаемые различными атомами одного и того же радиоактивного препарата, могут иметь разные величины энергии.