Эксклюзионная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся внутри пор сорбента, и растворителем, протекающим между его частицами.

В отличие от остальных вариантов ВЭЖХ, где разделение идет за счет различного взаимодействия компонентов с поверхностью сорбента, роль твердого наполнителя в эксклюзионной хроматографии заключается только в формировании пор определенного размера, а неподвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры. Поэтому применение термина «сорбент» к данным наполнителям в определенной степени условно.

Принципиальной особенностью метода является возможность разделения молекул по их размеру в растворе в диапазоне практически любых молекулярных масс – от 102 до 108, что делает его незаменимым для исследования синтетических и биополимеров.

По традиции процесс, проводимый в органических растворителях, все еще часто называют гель-проникающей, а в водных системах – гель-фильтрационной хроматографией. Принят единый термин, который происходит от английского «Size Exclusion» – исключение по размеру – и в наиболее полной степени отражает механизм процесса.

Детальный разбор существующих представлений о весьма сложной теории процесса эксклюзионной хроматографии проведен в монографиях. Мы рассмотрим только принципиальные основы метода, достаточные для практической работы.

Объем эксклюзионной колонки можно выразить суммой трех слагаемых:

Vс=Vо+Vi+Vd,

где Vо – мертвый объем – объем растворителя между частицами сорбента (объем подвижной фазы); Vi – объем пор, занятый растворителем (объем неподвижной фазы); Vd – объем матрицы сорбента без учета пор.

Полный объем растворителя в колонке Vt (его часто называют полным объемом колонки, так как Vd не принимает участия в хроматографическом процессе) представляет собой суммy объемов подвижной и неподвижной фаз:

Vt=Vо+Vi.

Удерживание молекул в эксклюзионной колонке определяется вероятностью их диффузии в поры и зависит от соотношения размеров молекул и пор, что схематически показано на рис. 2.15. Коэффициент распределения Kd, как и в других вариантах хроматографии, представляет собой отношение концентраций вещества в неподвижной и подвижной фазах:

Кd = Сi / Со.

Так как подвижная и неподвижная фазы имеют одинаковый состав, то Kd вещества, для которого обе фазы одинаково доступны, равен единице. Эта ситуация реализуется для молекул с самыми малыми размерами (в том числе и молекул растворителя), которые проникают во все поры (см. рис. 2.15) и поэтому движутся через колонку наиболее медленно. Их удерживаемый объем равен полному объему растворителя Vt.

Рис. 1. Модель разделения молекул по размеру в эксклюзионной храматографии

Все молекулы, размер которых больше размера пор сорбента, не могут попасть в них (полная эксклюзия) и проходят по каналам между частицами. Они элюируются из колонки с одним и тем же удерживаемым объемом, равным объему подвижной фазы Vo. Коэффициент распределения для этих молекул равен нулю.

Молекулы промежуточного размера, способные проникать только в какую-то часть пор, удерживаются в колонке в соответствии с их размером. Коэффициент распределения этих молекул изменяется в пределах от нуля до единицы и характеризует долю объема пор, доступных для молекул данного размера. Их удерживаемый объем определяется суммой Vo и доступной части объема пор:

VR=Vo+KdVi.

Отсюда следует еще одно существенное отличие эксклюзионной хроматографии: в данном методе разделение заканчивается до выхода пика растворителя, в то время как в других вариантах ВЭЖХ компоненты смеси элюируются после пика растворителя.

Параметр k' в эксклюзионной хроматографии обычно не используют. Его можно выразить уравнением

k' = KdVi / Vo.

Для большинства современных сорбентов Vi ≈ Vo, поэтому k' ≈ Kd.

Связь между удерживаемым объемом и молекулярной массой (или размером молекул) образца описывается калибровочной кривой (рис. 2.16). Каждый сорбент характеризуется своей калибровочной кривой, по которой легко оценить область разделяемых на нем молекулярных масс. Точка А соответствует пределу эксклюзии, или мертвому объему колонки Vo. Все молекулы, масса которых больше, чем в точке А, будут элюироваться одним пиком с удерживаемым объемом Vo. Точка В отражает предел проникания, и все молекулы, масса которых меньше, чем в точке В, также будут выходить из колонки одним пиком с удерживаемым объемом Vt. Между точками А и В располагается диапазон селективного разделения. Соответствующий ему объем Vi=Vt-Vo часто называют рабочим объемом колонки. Отрезок CD представляет собой линейный участок калибровочной кривой, построенной в координатах VR–IgM. Этот участок описывается уравнением

Vr = C1 – C2lgM,

где C1 – отрезок, отсекаемый на оси ординат продолжением отрезка СD, C2 – тангенс угла наклона этого отрезка к оси ординат.

Величину С2 называют разделительной емкостью колонки; ее выражают числом миллилитров растворителя, приходящегося на один порядок изменения молекулярной массы. Чем больше разделительная емкость, тем селективнее разделение в данном диапазоне масс. В нелинейных областях калибровочной кривой (участки АС и BD) в связи с уменьшением С2 эффективность фракционирования заметно снижается. Кроме того, нелинейная связь между IgM и Vr существенно усложняет обработку данных и снижает точность результатов. Поэтому всегда нужно стремиться выбирать колонку (или набор колонок) так, чтобы разделение анализируемого полимера протекало в пределах линейного участка калибровочной кривой.

Если какое-либо вещество элюируется с удерживаемым объемом больше Vt, то это указывает на проявление других механизмов разделения (чаще всего адсорбционного). Адсорбционные эффекты обычно проявляются на жестких сорбентах, но иногда наблюдаются и на полужестких гелях, видимо, из-за повышенного сродства к матрице геля. Примером может служить адсорбция ароматических соединений на стирол-дивинилбензольных гелях.

Рис. 2. Калибровочная кривая

Советские исследователи предложили теорию единого механизма жидкостной хроматографии полимеров на жестких гелях, из которой следует, что изменением параметров взаимодействия в системе полимер – сорбент – растворитель можно переходить от адсорбционного механизма к эксклюзионному и наоборот. В общем случае в эксклюзионной хроматографии нужно стремиться полностью подавить адсорбционные и другие побочные эффекты, так как они, особенно при исследовании молекулярно-массового распределения (ММР) полимеров, могут существенно исказить результаты анализа.

Принципиальными отличиями эксклюзионной хроматографии от других вариантов являются заранее известная продолжительность анализа в конкретной используемой системе, возможность предсказания порядка элюирования компонентов по размеру их молекул, примерно одинаковая ширина пиков во всем диапазоне селективного разделения и уверенность в выходе всех компонентов пробы за достаточно короткий промежуток времени, соответствующий объему Vt. Хотя данный метод применяют, главным образом, для исследования ММР полимеров и анализа макромолекул биологического происхождения (белки, нуклеиновые кислоты и т.д.), указанные особенности делают его чрезвычайно перспективным для анализа низкомолекулярных примесей в полимерах и предварительного разделения проб неизвестного состава. Получаемая при этом информация существенно облегчает выбор наилучшего варианта ВЭЖХ для анализа данной пробы. Кроме того, микропрепаративное эксклюзионное разделение часто используют в качестве первого этапа при разделении сложных смесей путем комбинации различных видов ВЭЖХ.