С обнаружением стерической и позиционной специфичности ФЛА2, были сформулированы довольно строгие минимальные требования фермента к субстрату: в положении sn-2 глицеринового остатка липид должен содержать сложноэфирную группу, а в положении sn-з - фосфатную. Позднее было показано, что остаток фосфорной кислоты может быть замещен сульфониевым: сульфолипид оказался хорошим субстратом ФЛА2, соответствующие фосфолппиды, где связь С-О-Р замещена на связь С-Р, также гидролизуются ферментом, но в меньшей степени. Поэтому минимальные требования фермента к субстрату в настоящее время сводят к тому, чтобы глицерофосфолипид обладал природной L-конфигурацией и имел сложноэфирную связь в sn-2-положении глицерина, а также содержал на расстоянии пяти-шести атомов от карбоксильного углерода группу с сильными анионными свойствами. Считается, что фосфатная группа должна иметь одну свободную кислотную функцию.

В фосфолипиде с двумя чувствительными сложиоэфирными связями - дифосфатидилглицерине(кардиолипинс) - гидролизоваться могут обе. Было установлено, что β-лецитины (1, 3-диацил-sn-глпцеро-2-фосфохолиньг) гидролизуются ФЛА2 из яда змеи Crotalus adaincniteus, хотя и со сравнительно низкой скоростью. ФЛА2 не гидролизует амидную связь сфинголипидов. Тиоловые аналоги фосфатидилхолинов являются хорошими субстратами, что позволяет следить за процессом гидролиза спектрофотометрически. Де Хаас и др. установили, что отрицательный заряд на фосфатной группе не является абсолютным требованием к субстрату.

Благодаря стерической и позиционной специфичности, ФЛА2 - ценный инструмент в химии и биохимии липидов. Их используют для установления позиционного распределения жирных кислот при анализе фосфоглицеридов, для разделения рацемических смесей липидов, а также в синтезе липидов для получения фосфоглицеридов со смешанным составом жирных кислот.

Субстратная специфичность клеточных ФЛА2 до сих пор еще полностью не очерчена, однако накоплены данные относительно строения субстратов для ФЛА2 клеток крови и иммунной системы, в частности, доказана специфичность этих ферментов к фосфатидилхолинам, содержащим в sn-2-положении глицерина арахидонат.

2.4 Ингибиторы ФЛА2

2.4.1 Неконкурентные ингибиторы

Снижение каталитической активности ФЛА2 может происходить вследствие нарушения равновесия на одной или на нескольких стадиях ферментативной реакции, поэтому известные ингибиторы этого фермента можно условно разделить следующим образом.

а) Связывание ингибитором фермента (Е) может сдвигать равновесие Е↔Е* влево и понижать концентрацию каталитически активного Е*. Это происходит при добавлении к везикулам субстрата везикул негидролизуемого аналога субстрата, с которым фермент связывается, но не может быстро десорбироваться. Необходимость наличия ионов кальция при связывании ФЛА2 с межфазной поверхностью дает основания относить к числу ингибиторов хелатирующие агенты, например EDTA.

б) Липофилъные соединения изменяют фазовые свойства субстратов и уменьшают плотность заряда на межфазной поверхности, сдвигая равновесие Е↔Е* влево. Было показано, что такие изменения вызывают органические растворители, детергенты, спирты, а также катионные амфифилы, фенотиазины и местные анестетики различной химической природы. Другие ингибиторы - жирные кислоты, мепакрин, аристолоховая кислота - также влияют на стадию связывания-десорбции Е↔Е*, не затрагивая каталитического действия фермента на межфазной поверхности.

в) Некоторые типы неспецифического ингибирования. При определенных условиях скорость гидролиза под действием ФЛА2 фосфолипидов, подвергшихся перекисному окислению, значительно увеличивается. Поэтому антиоксиданты считаются потенциально способными понижать активность фермента. Белки типа липокортина и калпактина солюбилизируют фосфолипиды межфазной поверхности, тем самым снижая активность ФЛА2. Водорастворимые анионы, такие как гепарин, ингибируют связывание ФЛА2 с межфазной поверхностью путем блокирования анионного участка связывания фермента.

г) Ковалентные модификации аминокислотных остатков ФЛА2. 1-Бромоктан-2- он и n-бромфенацилбромид ковалентно связываются с His-48 в каталитическом центре фермента и полностью угнетают каталитическую активность; скорость такой модификации значительно снижается, когда фермент уже связан с межфазной поверхностью. Диальдегиды, подобные госсиполу, модифицируют аминогруппы остатков лизина ФЛА2, ответственные за ее межфазное связывание; скорость модификации увеличивается в случае уже связанного с межфазной поверхностью фермента. Подобным образом действуют нестероидный терпеноид маноалид, выделенный из морской губки и его синтетический аналог маноалог.

д) Другие соединения. Предположительно, многие другие соединения, в том числе некоторые лекарства, подавляют активность ФЛА2 in vivo, однако, механизм их ингибиторного действия еще не выяснен. Среди таких веществ - биофлавоноиды и ретиноиды, гидроксиэйкозатетраеновые кислоты, фенофетол (агонист [β-адренэргических рецепторов), габексатмезилат, нисерголин, папаверин, циннаризин и амперон.

2.4.2 Конкурентные ингибиторы

Конкурентные ингибиторы ФЛА2 - это аналоги субстратов, продуктов реакции или комплекса переходного состояния. Они конкурируют с субстратом за связывание с активным центром молекулы Е*, эффективно понижая концентрацию комплекса ES*. Этот механизм ингибирования был экспериментально подтвержден при изучении катализа фосфолипидов под действием ФЛА2 по типу "scooting".

Общепринятая стратегия создания ингибиторов состоит в замене чувствительной к ФЛА2 сложноэфирной связи на негидролизуемую группу. При этом ингибитор должен оставаться близким структурным аналогом субстрата и не вызывать изменений в липидных мембранах. В настоящий момент не представляется возможным сопоставить имеющиеся данные о конкурентных ингибиторах, поскольку еще не выработано единой теории и количественного описания липолиза на границе раздела фаз липид/вода.

Аминоацильные фосфолипиды. Среди фосфатидилхолинов с модификацией.sn-2-сложноэфирной связи был открыт класс мощных конкурентных ингибиторов ФЛА2 - sn-2-амидных аналогов. Замена sn -2-сложноэфирной связи на простую эфирную связь или на углеводородный остаток также приводила к ингибированию ФЛА2 по конкурентному типу, но в меньшей степени.

Влияние аминоацильных аналогов фосфолипидов на ферментативную активность ФЛА2, исследовалось, в основном, в модельных экспериментах со смешанными мицеллами при соблюдении следующих условий:

1)общая концентрация липидов (ингибитора и субстрата) [I] + [S] должна быть постоянной для расчета мольной доли ингибитора, α = [I]/([I] + [S]);

2)молекулы субстрата и ингибитора должны занимать одинаковую площадь на межфазной поверхности;

3)межфазная поверхность мицелл должна быть достаточно большой, чтобы фермент находился только в связанной форме.

Для оценки воздействия ингибитора на активность ФЛА2 была использована условная величина ингибиторной силы (Z), которая является мерой соотношения констант межфазной диссоциации для субстрата и ингибитора и определяется выражением: