К настоящему времени не создан единый вариант метода препаративной ВЭЖХ, который обладал бы как большой скоростью и эффективностью разделения, так и высокой производительностью и экономичностью. Поэтому предложены варианты метода, значительно различающиеся по размерам и эффективности колонок, по производительности работы, требованиям к оборудованию и затратам на оборудование, сорбенты и растворители. При выборе оптимального варианта препаративной ВЭЖХ для каждой конкретной задачи. Исследователю приходится сталкиваться с рядом трудностей и проблем.

Первой и основной трудностью является высокая стоимость узко сепаративных сорбентов, особенно привитых, с размером частиц от 5 до 20 мкм. Если с этим можно мириться для аналитических колонок диаметром 2–5 мм, то стоимость резко растет при использовании колонок диаметром 10, 20 или 40 мм и может составить соответственно 200, 800 и 3200 рублей (без учета стоимости металлических колонок и работы по их заполнению). Кроме того, такие колонки достаточно непросто заполнять суспензионным способом.

Вторая трудность–создание хроматографов, насосы которых могли бы подавать растворитель при давлениях 5–20 МПа при расходе 5–100 мл/мин, а инжекторы позволяли бы водить без размывания пробы объемом 0,5–10 мл. Для таких насосов необходимы довольно мощные, дорогостоящие и тяжелые электродвигатели, сложные и дорогие уплотнения, клапаны и т.д.

Третья трудность–необходимость расходования больших объемов растворителей высокой чистоты, что приводит к большим затратам труда и времени на их регенерацию и очистку или к большим тратам на их приобретение. Расход растворителя достигает 10 л и более на 1 г препаративно выделенного очищенного продукта.

Наконец, существуют проблемы, связанные с ограниченной растворимостью образца в растворителе, повышенной вязкостью концентрированных растворов, взрыво- и пожароопасностью работы, необходимостью удаления больших объемов растворителей под вакуумом и т.д.

Конечно, все эти трудности возрастают по мере роста масштаба работы и количества вещества, которое нужно препаративно выделить или очистить. Отсюда первое правило: масштаб препаративного разделения должен быть мал настолько, насколько позволяют поставленные задачи.

Многие проблемы, связанные с выделением 1–10 мг чистых веществ для их идентификации современными высокочувствительными физико-химическими методами легко разрешаются на обычных аналитических колонках диаметром 4–5 мм путем многократного ввода проб и сбора фракций. Как правило, для таких работ не требуется никакого специального оборудования, кроме обычного аналитического хроматографа, а сбор фракций осуществляется вручную. Производительность работы можно увеличить без существенного изменения аппаратуры, заменив аналитическую колонку на препаративную диаметром 10–14 мм: как правило, насосы способны подавать до 5–10 мл/мин растворителя, а инжекторы–вводить 0,1–1 мл пробы. Правда, стоимость оборудования увеличивается на стоимость такой колонки, однако и производительность работы возрастет в 4–10 раз. Дальнейшего увеличения количества выделяемого вещества можно добиться уже только при значительном усложнении и удорожании оборудования.

Так, разделить большие количества на аналитическом хроматографе с колонкой диаметром 10–14 мм можно при увеличении продолжительности его работы, чего можно достигнуть путем автоматизации процесса ввода и сбора образца. Для этого хроматограф должен быть оснащен коллектором фракций, автоматическим устройством ввода пробы и компьютером, управляющим их работой. Для некоторых жидкостных насосов предусмотрена возможность установки специальных препаративных головок, иногда с рециклом разделенных фракций, позволяющих использовать эти насосы с колонками диаметром 20–25 мм (при производительности до 20–30 мл/мин) или 35–50 мм (до 100 мл/мин). Соответственно петлевой инжектор должен иметь достаточно широкие внутренние каналы и возможность установки петли размером до 10 мл. Конструкция и геометрия петли должны быть такими, чтобы обеспечивалось минимальное размывание образца при вводе пробы: длинные петли малого диаметра без резких изменений геометрии потока предпочтительней коротких и большого диаметра. Нередко удается заметно улучшить разделение, одновременно уменьшив размывание образца при вводе пробы путем ввода пробы без инжектора, установив вместо него тройник малого Ир объема и вводя пробу вспомогательным насосом высокого ржавления, работающим короткий отрезок времени. Менее удобным способом, дающим сходный результат, является ввод больших проб на колонку шприцем с использованием инжектора с прокалываемой резиновой мембраной, или краном малого объема, однако при этом ввод пробы (из-за ограниченного давления, которое можно создать шприцем даже хорошего качества: около 5 МПа для шприца емкостью 1 мл и около 1 МПа–для шприца емкостью 10 мл) осуществляют при остановке потока (выключении основного насоса).

При использовании колонок большого диаметра (10 мм и более) особое внимание должно быть уделено выбору сорбента. Как правило, дорогие узкодисперсные сорбенты с размером частиц 5 или 10 мкм для широких колонок использовать нецелесообразно из-за высокой стоимости и трудности суспензионной упаковки. Поэтому часто идут на компромиссное решение и используют препаративную фракцию того же сорбента с размером частиц 25–40 мкм или 40–70 мкм, которая выпускается рядом фирм специально для этих целей. Преимуществом такого сорбента является возможность упаковки сухим способом в колонки большого диаметра, более низкая стоимость (в 3–6 раз дешевле) при полном сохранении химической природы поверхности и пористости сорбента, используемого в аналитическом варианте. Кроме того, при работе с более крупным сорбентом требуется значительно меньшее давление, что упрощает работу и позволяет использовать более дешевое оборудование.

Выпускают также сорбенты для препаративной работы с размером частиц 15–25 мкм. Колонки, заполненные такими сорбентами суспензионным методом, имеют высокую эффективность. При использовании непривитого силикагеля, колонок очень большого диаметра (более 20 мм) и при необходимости очистки или выделения очень больших количеств вещества нередко практикуется применение дешевого и доступного сорбента. Часто используют силикагель для ТСХ (фракция 5–40 мкм), который нередко фракционируют седиментацией для сужения фракционного состава (отделяют пылевидные частицы, заметно повышающие гидравлическое сопротивление колонки, и наиболее крупные). Нередко применяют наиболее мелкую фракцию (40–70 мкм), имеющуюся в продаже для колоночной хроматографии. Однако переход на сорбент с другим размером и распределением пор и с несколько другими химическими свойствами поверхности может привести к заметному изменению разделения, удерживания, а иногда даже и порядка выхода разделяемых компонентов. Такие же изменения наблюдаются и при переходе от привитого сорбента одной фирмы к препаративному сорбенту другой фирмы.

Количество образца, которое можно ввести на колонку для препаративного разделения, зависит от многих факторов, и для каждого случая должно определяться экспериментально, предпочтительно с использованием аналитической колонки и растворов образца разной концентрации. В самом общем виде можно сказать, что масса образца, которую можно ввести, составляет от 0,1 до 1 мг на 1 г сорбента при отсутствии заметной перегрузки колонки пробой (снижение эффективности колонки менее чем в 2 раза). Как правило, препаративные разделения проводят при максимально возможной перегрузке колонки пробой, поэтому чем больше α для разделяемых компонентов, тем больше можно перегрузить колонку пробой и тем соответственно больше получить разделенного вещества за препаративный цикл. При разделении простых смесей, когда работают с большой перегрузкой, эффективность препаративных колонок с мелкими узкодисперсными сорбентами по основным пикам быстро падает, но по пикам примесей остается высокой, что позволяет отделять их более четко. При работе с большой перегрузкой эффективность по основным пикам для малоэффективных колонок и колонок средней и высокой эффективности близка. Однако по мере усложнения задачи (более сложные смеси, меньше α) допустимая перегрузка уменьшается и малоэффективные колонки становятся непригодными. они перестают обеспечивать разделение и получение чистых компонентов даже при отсутствии перегрузки.