Так как среди начинающих работать в области ВЭЖХ очень большой процент составляют специалисты по ГХ, имеет смысл сделать следующее замечание. Очень большой ассортимент неподвижных фаз (неоправданно большой, по мнению многих компетентных ученых) в ГХ и стремление иметь как можно более широкий выбор фаз и в ВЭЖХ–основная ошибка начинающих. Если в газовой хроматографии, по крайней мере в ее классическом варианте, подвижная фаза практически не оказывает влияния на селективность разделения, то в жидкостной хроматографии ее влияние огромно. Так как в разделении очень активно участвуют как привитая фаза, так и адсорбированные (абсорбированные) компоненты подвижной фазы, широкий ассортимент сорбентов для ВЭЖХ в большинстве случаев не нужен. Изменением состава подвижной фазы очень часто легко добиться той же селективности, что и за счет применения нового дорогостоящего привито-фазного сорбента. Приведенное выше утверждение не относится, конечно, к принципиально новым вариантам сорбентов для ВЭЖХ (например, особо широкопористым, предназначенным для работы с большими молекулами, такими, как белки). Для начинающего же работать в ВЭЖХ рекомендуется тщательно изучить 2–4 сорбента, находящие применение для его объектов исследования, и широкий ассортимент растворителей и добавок разного типа, их влияние на разделение данного класса веществ на выбранной группе сорбентов. Только после того, как приобретен опыт работы с привитыми фазами в комплексе с растворителями, но есть задачи, которые не удается решить с их помощью, следует пробовать новые привитые фазы. Справедливость данного замечания как раз и подтверждается тем, что 60–70% успешных разделений, описанных в литературе, проведено только на привитых фазах одного типа – обращенно-фазных, к рассмотрению которых мы сейчас и перейдем.

Наиболее популярными являются так называемые обращенные привитые фазы, применяемые в обращенно-фазной ВЭЖХ. Понятие «обращенный» пришло от классической ЖХ на силикагеле, где в «прямой» системе подвижная фаза неполярна. а неподвижная полярна (соответственно гексан и силикагель). По этому принципу «обращенная» система должна иметь полярную подвижную фазу и неполярную неподвижную (соответственно водный метанол и октадецилсилан на силикагеле, привитый химически). Названия обращенно-фазный сорбент и обращенно-фазная система не являются особенно удачными или понятными, однако так как это название общепринято, то мы будем его придерживаться.

Поверхность силикагеля, как известно, – довольно большая и развитая (обычно 100–600 м2/г), и в случае гидроксилированного силикагеля покрыта в основном силанольными группами, имеющими концентрацию около 5 на 1 нм2 поверхности. Расчетная максимальная плотность силанольных групп на поверхности несколько выше и составляет около 8 на 1 нм2. Полное гидроксилирование поверхности силикагеля достигается путем его обработки водой при кипении в течение нескольких часов.

Для получения обращенно-фазного сорбента гидроксилированный силикагель обычно обрабатывают хлорсиланами, которые вступают в реакцию довольно активно и образуют при этом устойчивые к гидролизу связи – Si-О–Si-С– Несмотдя на кажущуюся простоту процесса, оказалось, что имеются многочисленные сложности. Первоначально считали, что все силанольные группы вступят в реакцию с образованием мономолекулярного слоя привитой фазы. На практике оказалось, что не все силанольные группы, а только 1,5–2,2 на 1 нм2 вступят в реакцию с алкилхлорсиланами, а остальные не могут реагировать вследствие стерических препятствий и остаются на поверхности сорбента. Правда, привитые группы стерически затрудняют подход к ним молекул анализируемых веществ в процессе разделения.

Первоначально использовали для прививки промышленно доступные три- и дихлорсиланы (октадецилтрихлорсилан и др.), которые, будучи ди- и трифунк-циональными, способны вступать друг с другом в реакцию полимеризации до того, как вступят в реакцию с силанольными группами. Эта полимеризация приводит к тому, что на поверхности могут образоваться значительно более толстые, чем мономолекулярные, полимерные слои фазы (более или менее сильно привитые к поверхности силикагелевой матрицы). В этом случае содержание привитого углерода, определяемое сжиганием, окажется выше, чем теоретически должно привиться по схеме монослойного покрытия поверхности силикагеля. При этом, несмотря на сильное удерживание пробы из-за высокого содержания привитой фазы, эффективность разделения за счет затрудненной диффузии в толстых полимерных пленках может заметно упасть. В то же время большие участки поверхности силикагеля окажутся не покрытыми фазой, что приведет к сильному взаимодействию анализируемых веществ с неэкранированными силанольными группами.

Старые, давно разработанные обращенно-фазные сорбенты, как правило, получали обработкой силикагеля октадецил- или октилтрихлорсиланами. При этом покрытие поверхности было неполным, а привитые слои в той или иной степени (в зависимости от содержания воды в растворителе, степени безводности силикагеля, герметичности аппаратуры, технологии и т.д.) были полимеризованы.

Работа по улучшению качества привитого слоя велась разными учеными постоянно и в разных направлениях. С целью устранения полимеризации прививаемого агента было предложено использовать монохлорсиланы (например, диметилокта-децилхлорсилан, диметилоктилхлорсилан и др.), которые по природе своей монофункциональны и могут дать только мономерный привитой слой. Вода дезактивирует монохлорсиланы, вступая с ними в реакцию, однако в реакцию прививки они уже не вступают и после окончания реакции отмываются вместе непрореагировавшим исходным алкилдиметилхлорсиланом. С целью устранения влияния остаточных силанольных групп было предложено после проведения прививки вести так называемое «окончательное замещение», или «энд кэппинг». В этом случае после прививки основной фазы сорбент обрабатывают сильными реагентами с минимальным мольным объемом (на пример, триметилхлорсиланом), которые блокируют основную массу непрореагировавших силанольных групп. С целью получения сорбентов с более воспроизводимыми хроматографическими свойствами значительно больше внимания стало удеяться качеству растворителей и прививаемых силанов, подготовке (гидроксилированию) исходного силикагеля.

По мере разработки усовершенствованных методов прививки обращенных фаз практически все фирмы имели возможность использовать их для производства нового поколения сорбентов. Тем не менее не было прекращено производство старых сорбентов. В чем причина этого? Причин несколько, но основными являются две: наличие – налаженного производства сорбентов по старой технологии и нежелание его прекращать или перестраивать; разработанные методы анализа разных смесей и требования потребителей, не желающих менять свои методики анализа. Более консервативные фирмы, имеющие хороший сбыт старых обращенно-фазных сорбентов, продолжают их выпускать, а более прогрессивные наряду с выпуском старых организуют выпуск новых модификаций сорбентов, вводя для них отличительные знаки или цифры. Так, фирма «Ватман» имеет четыре варианта сорбента «октадецилсилан на силикагеле», при этом силикагелевая матрица одна и та же, фирма «Уотерс» – не менее трех, различающихся методом прививки и силикагелевыми матрицами (два сферической формы и один – неправильной), фирма «Фэйс Сепарейшн» – два варианта на одной силикагелевой матрице и т.д.