Рис. 3. Солюбилизация диметиламино-азобензола комплексами яичного альбумина с додецилсульфатом натрия

Сложный характер изотерм связывания ПАВ белками

Ассоциация ПАВ с белками напрямую доказывается изотермами связывания, которые можно измерить методом равновесного диализа или другими подходящими методами. Однако такие данные получены для ограниченного числа белков. Изотермы связывания характеризуются комбинацией слабого некооперативного связывания в области низких концентраций ПАВ и интенсивного кооперативного связывания при более высоких концентрациях ПАВ. Часто связывание ПАВ описывают так: сначала связывание малых количеств с высоким сродством к специфическим центрам связывания белка, а затем стадия кооперативного связывания. В ряде случаев ход изотермы связывания ПАВ белком аналогичен изотермам связывания ПАВ гиброфобизированным полимером, например как при взаимодействии додецилсульфата натрия с лизоцимом. При низких концентрациях наблюдается участок некооперативного связывания, за которым следует первая антикооперативная область, а затем протяженная область кооперативного связывания. При описании изотерм связывания для противоположно заряженных белка и ПАВ следует отметить явление осаждения. Было показано, что так называемое связывание с высоким сродством при низких концентрациях ПАВ включает осаждение стехиометрического комплекса. Белки, как и неионные полимеры, сильнее, взаимодействуют с анионными ПАВ, чем с катионными ПАВ. В то же время обнаружить ассоциацию белков с НПАВ часто не удается. Анионные ПАВ могут также образовывать ассоциаты с белками при рН выше их изоэлектрической точки, когда белок заряжен отрицательно.

Структуры и механизм образования комплексов ПАВ-белок почти не описаны. По-видимому, на первой стадии комплекс возникает за счет гидрофобных взаимодействий между гидрофобными «хвостами» ПАВ и неполярными остатками или доменами белка. Вторая стадия аналогична мицеллообразованию, индуцированному полимером. На этой стадии связывания происходит разворачивание молекулы белка, что делает доступным для взаимодействия с ПАВ гидрофобные группы белка, находящиеся внутри нативной глобулы. Таким образом, многие глобулярные белки постепенно переходят в состояние неупорядоченных клубков. В этом случае для описания комплекса белка с ПАВ используют модель структуры «жемчужного ожерелья», принятую для синтетических полимеров: гирлянда небольших глобулярных мицелл, декорирующая полипептидную цепь. По-видимому, образующиеся мицеллы имеют значительно меньшие числа агрегации, чем мицеллы индивидуального ПАВ или в присутствии гидрофильных полимеров.

Рис. 4. Изотерма связывания бычьим сывороточным альбумином додецилсульфата натрия и октилбензолсульфоната натрия. Связывание выражено числом молекул ПАВ на молекулу белка. Белые символы отвечают 10-2 M NaCl, черные —KT1 M NaCl

Рис. 5. а — Изотермы связывания додецилсульфата натрия бычьим сывороточным альбумином при различных рН: 3.8, 4.1, 4.8, 5.6 и 6.8 б — Изотерма связывания додецилсульфата натрия лизоцимом и осаждение белка из смешанного раствора в зависимости от концентрации додецилсульфата натрия

Высокая вязкость растворов смесей ПАВ и белков

Добавление ПАВ к растворам желатина при высоких концентрациях белка приводит к заметному увеличению вязкости, причем на зависимости вязкости от концентрации ПАВ регистрируется максимум. Аналогичные данные имеются и для смешанных растворов глобулярных белков и ионных ПАВ. Такое поведение подобно поведению смешанных растворов ПАВ и гидрофобизированных водорастворимых полимеров. Это согласуется с дифильной природой белка. Изменения вязкости связаны с образованием мицеллоподобных агрегатов, «сшивающих» молекулы белка.

Другое проявление дифильного характера белков обнаруживается при добавлении белка к раствору гидрофобизированного полимера. При добавлении лизоцима к раствору гидрофобизированного полиакрилата происходит значительное увеличение вязкости, однако при более высоких концентрациях белка вязкость понижается до исходного значения. Это очень похоже на эффект мицеллярных ПАВ при введении их в растворы полимеров. Причина в структурном сходстве глобул белка и мицелл ПАВ: наличие гидрофобного ядра и гидрофильной поверхности.

Фазовое разделение растворов смесей ПАВ-белок

Осаждение положительно заряженного белка при связывании анионных ПАВ — обычное свойство таких систем; при более высоких концентрациях ПАВ вновь происходит растворение осадка. Здесь опять проявляется общность свойств смешанных растворов ПАВ-белок с растворами смесей заряженных полимеров и противоположно заряженных ПАВ с той лишь разницей, что пары белок-ПАВ ведут себя намного сложнее. В этом можно убедиться на примере смесей растворов лизоцима и додецилсульфата натрия.

Рис. 6. Относительная вязкость растворов желатина в зависимости от концентрации добавленного додецилсульфата натрия; концентрация желатина: 0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.0 и 100 мас.%

Рис. 7. Зависимость вязкости 1%-ных растворов полиакрилата и гидрофобизированного полиакрилата от концентрации лизоцима в смеси.

При введении в раствор лизоцима небольших добавок ДСН образуется нейтральный комплекс в виде твердого вещества, находящийся в равновесии с избытком белка в растворе. Количество осажденного белка достигает максимального значения, когда связывание ДСН лизоцимом становится равным 8 молекулам ДСН на одну молекулу белка, т.е. точно равным числу положительных зарядов в молекуле лизоцима. При значительном избытке ПАВ осадок растворяется. Чем короче алкильные цепи ПАВ, тем больше должна быть его концентрация для растворения осадка. Растворение осадка отвечает кооперативной части изотермы связывания в условиях, когда концентрация свободного ПАВ достигает KKM.

Чем ниже концентрация ПАВ, приводящая к осаждению комплекса, тем ниже содержание воды в осадке, и в этом случае стехиометрия комплекса определяется глобулярной природой белка. Уникальная третичная структура нативного белка контролирует образование комплексов определенного состава. Поэтому содержание воды в осадке, образованном жесткими частицами, невелико, тогда как в гелеобразных коацерватах, образующихся в смесях ПАВ и гидрофобизированных водорастворимых полимеров, содержится большое количество воды.

Кооперативное связывание и осаждение нейтрального комплекса при малых концентрациях ПАВ можно описать в терминах произведения растворимости Ks нейтрального комплекса, образованного отрицательно заряженным ПАВ и положительно заряженным белком, согласно уравнению