10) Промываем водой: заливаем дисцилированную воду в центрифужные стаканчики тщательно перемешиваем и центрифугируем на 4000 об/мин. промываем до тех пор пока рН среды не будет нейтральным.

2.3 Растворение целлюлозы

Получение раствора хлорида лития в N, N – диметилацетамиде

1) N, N-диметилацетамид (ДМА) сушили над молекулярными ситами 4А.

2) В колбу присыпали 8 гр. хлорида лития и нагревали в термостате до 1800 в течение 4–5 часов, затем охлаждали и приливали 100 мл. высушенного над молекулярным ситом ДМА.

3) Колбу закрывали стеклянной пробкой и раствор перемешивали на шейкере до растворения хлорида лития (оставляли на ночь).

Выделение прочно связанных полисахаридов из растворенной целлюлозы клеточной стенки ксилемы льна

1) 1 гр. «целлюлозы» суспензировали в 10 мл. воды 40–60 мин.

2) Отделяли на воронке Шота со вставленным нейлоновым фильтром.

3) Осадок промывали на фильтре ацетоном.

4) Выдерживали в ацетоне (10 мл., 60 мин.)

5) Осадок промывали на фильтре ДМА

6) Выдерживали в ДМА (10 мл., 40–60 мин.)

7) Оставляли на ночь в свежей порции ДМА

8) На воронке шота отделяли «целлюлозу»

9) Суспензировали ее в 100 мл раствора хлорида лития в N, N – диметилацетамиде.

10) Колбу закрывали стеклянной пробкой и перемешивали до растворения целлюлозы на шейкере (1–2 дня).

11) Раствор целлюлозы по каплям добавляли к 100 мл. дисцилированной воды при перемешивание на магнитной мешалке. Раствор оставляли на ночь.

12) Отделяли выпавшую целлюлозу на воронке Шота с нейлоновым фильтром и промывали ее два – три раза дисцилированной водой (по 50 мл.) Получили Фильтрат 1

13) Фильтрат 1 Заливали в диалезный мешок 12 – 14 тысяч Дальтон.

14) Диалезный мешок клали в 3-х литровую банк с дисцилированной водой и ставили на магнитную мешалку, воду в банке меняли 4 раза.

15) На роторном испарителе концентрировали раствор.

16) Хроматографируем концентрированный раствор. Готовим 40 пробирок, моем их хромкой и сушим в сушильном шкафу при 1200С.

17) На хроматографе задаем программу (по каплям, 40 пробирок, в одну пробирку 40 капель ≈ 1,8 мл.)

18) В эпиндорф вливаем концентрированный раствор и центрифугируем 5 мин. при 6 000 об/мин.

19) Хроматографирование на Sepharose CL-4B элюент 0,02% NaN3 и АсNa 10 mM pH 5,5, разделение по молекулярным массам.

20) Определяем количество сахаров методом Дюбуа (фенольным методом). 200 мкл образца+200 мкл 5% раствора фенола, помещаем пробирки в холодную воду и добавляем 1 мл. концентрированной серной кислоты. Кипятим на водяной бане 10 минут и охлаждаем. Измеряем оптическую плотность при 490 нм. (Смотри гафик1)

21) Выпавшую целлюлозу суспензировали в 50 мл 0,01 М растворе NaAc, рН 4,5 + 0,05% NaN3, содержавший 0,1 мл раствора целлюлазы и инкубировали в течение ночи.

22) Раствор фильтровали на воронке Шота и осадок заново суспезировали в новой порции раствора фермента. Мы получили фильтрат 2.

23) Фильтрат 2 обессоливали на колонке Sephadex G-25, элюент 0,02% NaN3. 0,005 гр. Blue Dextran 2000 кД и 0,250 гр. СоCl2 растворяли в 5 мл дисцилированной воды и хроматографируем. Blue Dextran 2000 кД начало 25 мл конец 30 мл. СоCl2 начало 60 мл. конец 73 мл.

24) Хроматографирование на Sepharose CL-4B элюент 0,02% NaN3 и АсNa 10 mM pH 5,5, разделение по молекулярным массам.

25) Определяем количество сахаров методом Дюбуа (фенольным методом). 200 мкл образца+200 мкл 5% раствора фенола, помещаем пробирки в холодную воду и добавляем 1 мл. концентрированной серной кислоты. Кипятим на водяной бане 10 минут и охлаждаем. Измеряем оптическую плотность при 490 нм (Смотри график2).

2.4 Моносахаридный анализ

1) Фильтрат 1 и Фильтрат 2 обессоливаем на колонке Sepharose G250, элюент 10мМ пиридин и 10мМ уксусная кислота рН 4,5.

2) Высушиваем при 600С до полного отсутствия воды.

3) Добавляем 400 мл ТФУ (Трифторуксусная кислота), помещаем в сушильный шкаф на 1 час при температуре 1200С.

4) Затем опять сушим при 600С

5) Растворяем водой и определяем моносахаридный соcтав на Daionex (Данные моносахаридного состава смотри в таблице 1).

6) Мы объединили наши пробирки в следующие фракции до целлюлазной обработки: фракция 1 5–10; фракция 2 11–16; фракция 3 17–23; фракция 4 24–26; фракция 5 27–35.

Фракции после целлюлазной обработки: фракция 1 6–10; фракция 2 11–16; фракция 3 17–19; фракция 4 20–24; фракция 5 25–26; фракция 6 27–31.

Рисунок 1 – Распределение прочносвязанных полисахаридов во фракциях после растворения целлюлозы до ферментативной обработки.

Рисунок 2 – Распределение прочносвязанных полисахаридов после растворения после ферментативной обработки

Таблица 1. Моносахаридный состав во фракциях