Питательная среда для выращивания продуцентов глутаминовой кислоты состоит из мелассы, кукурузного экстракта или другого источника ростовых веществ, мела и пеногасителя. Питательная среда готовится и стерилизуется в две стадии с учетом свойств компонентов, входящих в ее состав. Стадия подготовки и стерилизация среды состоят из смешивания компонентов питательной среды в определенной пропорции с помощью специальных дозаторов в реакторе, растворения солей при перемешивании, нагрева до температуры стерилизации, выдержки при этой температуре в течение 1 часа и охлаждения до температуры, при которой проводится культивирование продуцента глутаминовой кислоты.

Термолабильные компоненты среды, например мелассу, содержащую сахарозу стерилизуют отдельно. В реактор, снабженный мешалкой, подают мелассу и нагревают ее при постоянном размешивании до температуры 80°С, с периодическим добавлением к раствору определенного количества воды. Собственно стерилизацию осуществляют путем быстрого разогрева полученного раствора глухим паром до 120–122°С в специальном аппарате и выдерживают при этой температуре определенное время, необходимое для полной гибели всей микрофлоры. Охлажденный раствор сжатым стерильным воздухом передают в предварительно подготовленный ферментатор. Температура стерилизации мелассы выше, а длительность значительно меньше, чем те же параметры при стерилизации остальных компонентов среды.

Пеногаситель, используемый на стадиях культивирования продуцента в посевном аппарате и основном ферментере, особенно в том случае, когда им является масло или жир, стерилизуется отдельно. Режимы стерилизации (температура и длительность) при обработке пеногасителя более жесткие, чем это принято для стерилизации любых питательных сред.

Процесс получения глутаминовой кислоты требует строгих асептических условий, и поэтому особое внимание уделяется стерилизации не только среды, но и всех реакторов, коммуникаций, подаваемого воздуха.

При стерилизации аппаратуры режимы стерилизации зависят главным образом от материала, из которого изготовлено оборудование и его отдельные узлы. Наибольшая эффективность стерилизации аппаратуры и коммуникаций наблюдается при применении острого пара, имеющего температуру 135–140°С. Но отдельные блоки аппаратов, в том числе датчики измерительных приборов, не выдерживают таких условий стерилизации, и потому в этих случаях могут применяться «холодные» способы стерилизации. Для такой обработки могут быть использованы бактерицидные газы (этилен) и растворы химических реагентов (формалина, смеси цитилпиридинового бромида и этанолмеркурихлорида в соотношении 2:1, различные производные фенола и их смеси, аммонийные соли первичных и вторичных алкилсульфатов, хлорсодержащие соединения, |3-пропиоллактон и т.д.).

Степень стерильности среды, оборудования и коммуникаций может быть проверена. Простерилизованную среду или смывы, произведенные стерильной водой с внутренних поверхностей аппаратов и трубопроводов, высевают на агаризованные или жидкие питательные среды и инкубируют в термостате сутки. Если среды остаются стерильными, то стерилизация проведена качественно. Такой анализ проводится при пуске завода, в случае появления инфекции и периодически в профилактических целях. [2]

5.3 Приготовление исходной и посевной культуры

Посевной материал на каждой из стадии его получения (от пробирок до посевного аппарата) выращивают в строго асептических условиях по 24 ч. Состав питательных сред незначительно меняется при переходе от одного штамма к другому и практически остается постоянным на каждой из промежуточных стадий получения посевного материала. Только при выращивании продуцента в посевном аппарате в питательную среду вносят до 0,1% стерильного синтетического пеногаситсля.

Накопление биомассы до 6–8 г. АСВ на 1 л среды производят в аэробных условиях сначала в инокуляторах объемом 2 м3, потом в посевных аппаратах объемом 5 м. Полученный посевной материал в количестве 5–6% (от объема среды производственных аппаратов) стерильно передают в основные ферментаторы на 50 м3. Коэффициент заполнения аппарата 0,7. [2]

5.4 Выращивание продуцента в ферментаторе

Процесс биосинтеза осуществляют в строго асептических условиях в ферментаторах объемом 50 м3 с коэффициентом заполнения аппарата 0,7 в течение 48–52 ч и интенсивной аэрации [80–85 мг Ог/(л-мин)], что соответствует расходу 1 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин. Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной на уровне 28–30°С. В конце процесса биосинтеза готовая культуральная жидкость содержит до 45 г./л глутаминовой кислоты. Выход глутаминовой кислоты по отношению к потребленным сахарам составляет 45–50%.

Поскольку производство глутаминовой кислоты направлено на получение высокоочищенных препаратов, последующая технологическая схема предусматривает производство продуктов, подготовленных непосредственно к применению в качестве пищевых добавок и в виде лекарственных форм.

Выделение глутаминовой кислоты из культуральной жидкости и последующая очистка ее в соответствии с требованиями фармакопеи

предполагает такую последовательность проведения технологических операций. [2]

5.5 Предварительная обработка культуральной жидкости

Осуществляется в результате добавления к ней определенного количества негашеной извести (или известкового молока) с последующим осаждением избытка ионов кальция фосфорной кислотой. Образующийся при этом осадок способствует лучшему отделению клеток продуцента и других балластных примесей. [2]

5.6 Отделение биомассы от культуральной жидкости

Проводят центрифугированием или фильтрованием под давлением. [2]

5.7 Осветление фильтрата

Состоит в очистке его от пигментных примесей, окрашивающих нативный раствор в темный цвет. Для этого обрабатывают фильтрат активированным углем или подвергают его ионообменной сорбции на анионите ИА-1. [2]

5.8 Концентрирование осветленного раствора глутаминовой кислоты

Проводят путем его вакуум-выпаривания при температуре 40–60 °С, при этом из исходного раствора глутаминовой кислоты отгоняют от 50 до 80% воды. [2]

5.9 Осаждение кристаллов глутаминовой кислоты в изоэлектрической точке

Эта стадия осуществляется путем подкисления полученного на предыдущем этапе концентрата соляной кислотой до рН 3,2 (изоэлектрическая точка глутаминовой кислоты) и охлаждения раствора до 4–15°С. Однократное проведение операции обеспечивает кристаллизацию 77% глутаминовой кислоты; при повторном ее проведении выход возрастает до 87%. Чистота получаемых кристаллов достигает 88%.

В результате последующей перекристаллизации чистоту получаемых кристаллов можно увеличить до 99,6%, что удовлетворяет требованиям фармакопеи. [2]

5.10 Отделение кристаллов глутаминовой кислоты от маточника

Это достигается центрифугированием с последующей декантацией и возвратом маточника на стадию вакуум-выпаривания. Полученные кристаллы промывают обессоленной водой и направляют на сушку. [2]