Описание получения сорбентов для ВЭЖХ, представленное выше, показывает, что процесс несложен и достаточно производителен. Полученные сорбенты по качеству не уступают имеющимся в продаже, а иногда превосходят их.

Однако при получении сорбентов этим способом следует тщательно соблюдать ряд условий. Прежде всего, все операции необходимо проводить с одной партией исходного силикагеля. Нужно строго соблюдать постоянство высоты слоя суспензии в стаканах и интервалы времени. В случае ошибки всегда лучше снова взмутить суспензию и повторить седиментацию правильно. Не следует применять больших усилий при взмучивании осадка, так как это может привести к раздавливанию большого количества частиц и ухудшению фракционного состава осадка. Наконец, при возможности нужно проводить ультралевую обработку каждой суспензии, так как это способствует разрушению слипшихся частиц (комочков) и отделению от частиц прилипших к ним субмикронных пылевидных частиц наличие которых ухудшает проницаемость и эффективность колонок с таким сорбентом.

Из силикагеля марки КСК-2 узкие фракции сорбентов для ВЭЖХ получают аналогичным способом, добавляя стадию размола исходного кускового силикагеля. Выбирая мельницу для размола, всегда обращайте внимание не только на ее производительность и степень измельчения, но и на материал ее конструкции. Продукты износа корпуса и мелющих тел мельницы должны присутствовать в размолотом силикагеле в минимальном количестве. Требования к материалам мельницы несколько менее жестки, если предполагается в дальнейшем химическое облагораживание полученных сорбентов кипячением с хлороводородной, азотной кислотами или их смесью. При этом удаляются соединения металлов переменной валентности, присутствовавшие в исходном

силикагеле (в первую очередь железа, окрашивающего КСК-2 в цвета от светло-желтого до коричневого), и внесенные в процессе размола. Такую деминерализацию силикагеля часто проводят фирмы, производящие сорбенты: при этом цвет сорбента становится белым, его каталитическая активность сводится к минимуму и одновременно гидроксилируется поверхность, что необходимо для дальнейшей полной химической прививки.

Любой ли силикагель можно использовать для получения сорбентов для ВЭЖХ таким образом? Нет, не любой. Следует учитывать не только физико-химические характеристики, приведенные в паспорте и важные для использования силикагеля в качестве осушителя, носителя катализаторов или сорбентов для ГХ. Очень важной характеристикой является его стабильность в водных суспензиях и механическая прочность, так как, если силикагель непрочен в силу технологии его получения или теряет прочность в процессе размола и приготовления суспензии, он непригоден для ВЭЖХ. Прежде всего это относится к силикагелям, нашедшим широкое применение в ГХ в качестве адсорбентов, получаемым из частиц аэросила и имеющим марки силохром С-80, С-120 и др. Приступающим к работе с новым видом силикагеля следует обратить особое внимание на размер пор, объем пор и технологию получения силикагеля данного вида. Чем больше объем пор и их размер, тем, как правило, менее прочен силикагель, но и тем больший интерес он представляет для такого применения, как получение сорбентов для эксклюзионной хроматографии, для анализа больших молекул в ионообменном и обращенно-фазном вариантах ВЭЖХ (белки, полипептиды и др.). Иногда сорбенты с одинаковыми или близкими характеристиками по размеру и объему пор, но полученные по разной технологии (или при нарушениях технологии), могут различаться по прочности в 2—10 раз. Особенно это относится к сорбентам, получаемым из тетраэтоисисилана формованием микросфер с последующим отверждением (сорбенты типа лихросфер фирмы «Мерк»).

Поэтому можно принять за правило, начиная работу по получению сорбентов для ВЭЖХ из силикагеля новых видов или партий, не делать сразу большую порцию, а получить 4—6 г сорбента и испытать его, заполнив несколько колонок при разных давлениях и испытав их характеристики. Если, например, уже при давлении набивки около 20 МПа колонка имеет резко увеличенное (по сравнению с другим сорбентом из механически прочного силикагеля той же фракции) сопротивление потоку растворителя, то трудно рассчитывать на то, что удастся получить высокоэффективные колонки, заполненные сорбентом этого вида с частицами размером около 5 мкм. Если же колонки, заполненные при 20, 40 и 60 МПа, имеют близкую проницаемость, можно делать большую партию сорбента и быть уверенным в ее качестве.

1.2 СУСПЕНЗИОННЫЕ МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КОЛОНОК ДЛЯ ВЭЖХ

Приготовление колонок для ВЭЖХ из частиц сорбента размером от 3 до 12 мкм долго было для специалистов по ВЭЖХ труднопреодолимой проблемой. Так как при измельчении любых твердых тел их поверхность контакта резко возрастает, мелкие частицы приобретают способность заряжаться, слипаться в трудно разрушаемые комочки либо отталкиваться друг от друга с образованием неравномерно распределенных пустот.

Рис .5.1. Схема устройства для суспензионного заполнения колонок:

1—капилляр для подачи растворителя от насоса; 2—верхний фитинг резервуара; 3—резервуар для суспензии; 4—нижний фитинг резервуара; 5—предколонка; 6—рассверленный под наружные диаметры колонки и предколонки фитинг; 7—колонка; 8—фитинг колонки; 9—слив растворителя в мерный цилиндр

Сорбент в заполненной традиционным методом «насыпай и уплотняй постукиванием» колонке для КХ после того, как в нее подавали растворитель, уплотнялся с образованием пустот в начале колонки, при этом форма пиков получалась неправильной, а эффективность колонки — низкой.

Разработка суспензионных методов приготовления колонок позволила резко поднять эффективность и использовать сорбенты размером 10 мкм и меньше. Однако суспензионный метод еще недостаточно отработан, и существует множество его вариантов, каждый из которых имеет свои особенности. Часто тот вариант, который описан в литературе, не дает в других руках хороших результатов, так как невозможно описать и воспроизвести все детали процесса суспензионной упаковки.

Вкратце процесс суспензионной упаковки выглядит следующим образом. Взвешивают требуемое для колонки данного размера количество сорбента, заливают его растворителем и приготавливают суспензию, тщательно перемешивая смесь, нередKO с использованием ультразвука. После этого суспензию помещают в резервуар, соединенный с колонкой, на конце которой установлен фитинг с фильтром (рис. 5.1), и под давлением 20—60 МПа продавливают суспензию через колонку, подавая резервуар насосом растворитель. Суспензия фильтруется на фильтре колонки, формируя упорядоченный слой сорбента, обеспечивающий эффективное разделение при ВЭЖХ. Останавливают поток растворителя, дают давлению упасть до нуля и снимают колонку. Аккуратно удаляют избыток сорбента с конца колонки, присоединявшегося к резервуару, и присоединяют второй фитинг с фильтром. Полученную таким образом колонку устанавливают на хроматограф, прокачивают через нее до установления равновесия рабочий растворитель, после чего она готова к работе.