Колонки со стирол-дивинилбензольными сорбентами, выпускаемые разными фирмами, заметно различаются по эффективности и размеру линейного участка калибровочной кривой (рис. 4). Эти различия вызваны особенностями микроструктуры пор, размером и тщательностью сепарирования и упаковки частиц сорбента. Наиболее эффективными являются колонки шодекс типа KF, ультрастирогель и TSK-гель серии XL. Гарантированная эффективность этих колонок достигает 45 – 50 тыс. т.т./м. Линейный участок калибровочной кривой для стирол-дивинилбензольных гелей обычно соответствует изменению молекулярной массы в пределах 1–2 порядков.

Некоторые фирмы выпускают специальные колонки, заполненые смесью сорбентов различной пористости в таких соотношениях, которые обеспечивают наилучшую линейность калибровочной кривой в диапазоне 4–5 порядков. Естественно, что разделительная емкость таких колонок относительно невелика, но они очень удобны для предварительного исследования полимерных материалов с неизвестным ММР, а также для быстрого сравнительного анализа различных образцов, в частности, в аналитическом контроле производства.

Большой интерес для эксклюзионной хроматографии представляют гели сферон. Эти макропористые сорбенты с высокой плотностью сшивки получают сополимеризацией оксиэтилметакрилата с этилендиметакрилатом. Они набухают как в воде, таК и во многих органических растворителях, в частности, в тетрагидрофуране. Степень набухания гелей в разных растворителях почти одинакова и не меняется в широком интервале эачений рН и ионной силы, что позволяет рассматривать их как универсальные сорбенты для эксклюзионной хроматографии в органических растворителях и водных системах. Иногда можно заменять водный растворитель на органический в провесе разделения, т.е. работать в режиме градиентного элюирования.

Гели сферон обладают высокой удельной поверхностью (50–200 м2/г), механической прочностью (допустимое давление выше 10 МПа) и термостойкостью до 200 °С. Выпускается пять типов гелей разной пористости с пределом эксклюзии по декстрану от 6-Ю4 до 108. Нижний предел проницаемости гелей всех типов одинаков и составляет около 103. Высокая химическая стойкость позволяет использовать сфероны. в диапазоне рН = 1–12.

Для ВЭЖХ используют фракции сферона с размером зерен менее 25 мкм, которые очень желательно дополнительно седиментировать. С 1985 г. начат выпуск сорбентов сферой микро с размером зерен 12, 16 и 20 мкм, которые отличаются более узким распределением по размеру частиц и повышенной механической прочностью. В литературе приведено много примеров использования сферонов для разделения гидрофильных полимеров, белков, нуклеиновых кислот и других биологических объектов. При этом неоднократно наблюдали заметную адсорбцию некоторых биополимеров на матрице геля, что иногда повышает эффективность разделения.

В последние годы разработан ряд новых полимерных сорбентов для эксклюзионной хроматографии в водных системах. На рис. 5 приведены калибровочные кривые для некоторых материалов. Гели шодекс ОН-пак изготавливают на основе поливинилового спирта (серия Q) и полиглицидилметакрилата (серия В). Первые предназначены для разделения в низкомолекулярной области (М<1500 по полиэтиленгликолю или 5000 по декстрану), а вторые – для высокомолекулярного диапзона. Оптимальная рабочая температура для колонок с этими материалами составляет 50 °С. Сорбенты типа ионпак 5 представляет собой сульфированные стирол-дивинилбензольные гели и особенно пригодны для разделения полиолов и исследования молекулярно-массового распределения полисахаридов (рис. 4.8) при рабочих температурах 40–80 °С. TSK-гели типа PW дают очень хорошие результаты при определении ММР водорастворимых синтетических полимеров (полиакриламиды, соли полиакриловой кислоты, поливинилпирролидон и т.д.), а также алеиновых кислот, полиэтиленоксида и полисахаридов. Эти материалы обладают наилучшими характеристиками для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии поликатионов в водНОЙ среде. В качестве подвижных фаз при анализе неионных веществ на этих сорбентах используют воду или 0,005 – 0,1 М водные растворы солей (например, NaCI или КСl); для разделения полиэлектролитов на TSK-геле типа PW применяют буферные системы. Наиболее мелкопористые гидрофильные гели очень эффективны для разделения низиомолекулярных соединений.

К недостаткам полужестких гелей следует отнести ограничение по растворителям, значительное время уравновешивания колонок и возможное снижение их эффективности при замене подвижной фазы, а также относительно невысокое предельное рабочее давление. Кроме того, эффективность колонок с полужесткими гелями может резко понизиться при попадании в них пузырьков воздуха. Воздух блокирует поры геля и очень трудно удаляется. Поэтому при работе с полужесткими гелями требуется особенно тщательная дегазация растворителя и внимательная сборка хроматографической системы.

Жесткие гели

Из жестких неорганических сорбентов в эксклюзионной хроматографии используют, главным образом, силикагели и в значительно меньшей степени пористые стекла. Основными достоинствами этих материалов является возможность использования с любым растворителем, простота их замены, высокая устойчивость к давлению и температуре и относительная легкость упаковки, колонок. Главный недостаток жестких гелей – адсорбционная активность, которая в наибольшей степени выражена у пористых стекол. Для ее устранения поверхность модифицируют силанизацией или прививкой различных групп, в частности сложноэфирных (µ-бондагель Е), остатков глицерина (гликофаза G/CPG) и др. К сожалению, модификацией поверхности полностью подавить адсорбцию обычно не удается. Поэтому приходится устранять ее путем различных добавок к подвижной фазе, которые взаимодействуют с сорбентом сильнее, чем анализируемые вещества. При работе в органических средах в качйстве модифлкаторов часто применяют тетрагидро-фуран и додигликоли (если, конечно, нельзя по каким-либо причинам, вести разделение в чистом полярном растворителе). При работе в водных растворах и анализе полиэлектролитов к элюенту добавляют, различные соли (иногда кислоты и основания), подавляющие: адсорбционные и полиэлектролитные эффекты. Друдой недостаток жестких гелей–ограниченное разрешение в области низких молекулярных масс: для данного диапазона лучше использовать полужесткие сорбенты.

Первоначально для разделения полимеров применяли различные промышленные силикагели. Изучен ряд силикателей, выпускаемых в СССР, и предложен набор из четырех марок (КСК-2; КСК-1; силохром СХ-1 и МСА-2500), перекрывающий диапазон молекулярных масс от 103 до 106. Главный недостаток промышленных силикагелей заключается в плохой воспроизводимости их характеристик за счет весьма широких допусков, которые вполне допустимы при их использовании в технике. Кроме того, существенным затруднением является необходимость размола и выделения узких фракций с требуемым размерим частиц, как описано в разд. 5.1. Поэтому были разработаны силикагели, специально предназначенные для эксклюзионной хроматографии. Первым из таких сорбентов был лихросфер. Сферические частицы сорбента имеют большой удельный объем пор, хорошие механические свойства и позволяют получить колонки достаточно высокой эффективности.