СОДЕРЖАНИЕ

1. Подвижная фаза для ВЭЖХ

1.1 Основные требования к растворителям

1.2 Элюирующая сила растворителя и элюотропные ряды

1.1 Элюотропные серии для адсорбционной хроматографии на силикагеле

1.3 Смеси растворителей

1.5 Очистка растворителей для ВЭЖХ

1.4 Селективность растворителя

Литература

1. ПОДВИЖНАЯ ФАЗА ДЛЯ ВЭЖХ

Роль подвижной фазы (растворителя) в жидкостной хроматографии весьма многообразна. Наряду с чисто транспортной функцией растворитель активно участвует в самом процессе разделения и оказывает существенное влияние на возможности детектирования. Часто незначительное изменение состава подвижной фазы дает возможность оптимизировать процесс, улучшить форму пиков, разрешение отдельных компонентов и даже изменить механизм разделения. Поэтому при выборе растворителей необходимо учитывать весь комплекс их свойств, в той или иной степени влияющих на проведение хроматографического эксперимента. Свойства растворителей для ВЭЖХ приведены в приложении 2. Данные по физико-химическим характеристикам растворителей в основном взяты из наиболее авторитетных источников.

1.1 ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К РАСТВОРИТЕЛЯМ

Растворители, применяемые в ВЭЖХ, должны удовлетворять следующим основным требованиям: чистота, химическая инертность, совместимость с детектором, достаточная растворяющая способность по отношению к анализируемым веществам, низкая вязкость, безопасность, доступность. В некоторых случаях существенное значение имеют смешиваемость с другими растворителями, температура кипения и возможность легкого извлечения вещества из элюата. Чистота растворителя в жидкостной хроматографии имеет очень большое значение, так как различные примеси в подвижной фазе влияют на все основные стадии процесса: подачу растворителя, разделение в колонке, детектирование и воспроизводимость результатов. Требуемая степень чистоты растворителя определяется выбранным вариантом разделения и используемой аппаратурой. Наличие примесей в растворителе может вызвать следующие типичные затруднения.

1. Ухудшение эффективности разделения и воспроизводимости результатов (пример — неконтролируемая влажность растворителя в адсорбционной хроматографии).

2. Сильное отклонение нулевой линии и образование ложных пиков при градиентном элюировании.

3. Ухудшение возможностей детектирования (примеры — примеси олефинов в парафиновых углеводородах при УФ-детектировании, примесь этанола в хлороформе при ИК-детектировании).

4. Порча сорбента: примеси оснований приводят к растворению силикагеля; примеси диенов и других лабильных соединений осмоляются и блокируют поверхность адсорбентов, особенно оксида алюминия; примеси карбонильных соединений реагируют с привитыми сорбентами, содержащими аминогруппу; пероксиды окисляют привитые фазы и полистирольные гели.

5. Загрязнение веществ, выделяемых из элюата. В препаративной хроматографии приходится выделять вещества из очень разбавленных растворов. При этом даже незначительные примеси или добавки, которые не мешают аналитическому разделению, могут концентрироваться в извлекаемом веществе, существенно снижая его чистоту.

6. Разложение или химическое изменение компонентов пробы (типичные примеры — гидролиз многих металлоорганических соединений, окисление лабильных веществ пероксидами или растворенным кислородом).

7. Коррозия аппаратуры (пример — примесь НСl в хлорсодержащих растворителях).

Химическая инертность. Все, что сказано выше о химически активных примесях, имеет гораздо большее значение применительно к химической активности самих растворителей. Дополнительно можно отметить, что такие классы соединений, как кетоны, алифатические и ароматические амины, следует применять с особой осторожностью и только в тех случаях, когда их трудно заменить более стабильными растворителями. Такие элюенты, как хлорорганические соединения, тетрагидрофуран и другие простые эфиры, следует использовать только свежеочищенными. Совместимость с детектором. Наиболее распространенными детекторами в настоящее время являются УФ-детекторы и дифференциальные рефрактометры. Возможность использования тех или иных растворителей в сочетании с УФ-детектором принято определять минимальной длиной волны, на которой при оптическом пути 10 мм падение интенсивности светового потока составляет 90%. Граничные длины волн, относящиеся к растворителям очень высокой степени очистки, приведены в приложении 2. Рассмотрение этих данных показывает, что с УФ-детектором практически не могут быть использованы такие растворители, как бензол, толуол, тетрахлорид углерода, диметилформамид и хлороформ, а также сложные эфиры и кетоны. С рефрактометрическим детектором в принципе можно применять любые растворители, но его чувствительность определяется разностью показателей преломления растворителя и анализируемого вещества. Поэтому при выборе растворителе следует учитывать его показатель преломления. Вязкость растворителя должна быть по возможности низкой, так как ее повышение ведет к ухудшению массопередачи, а тем самым и эффективности разделения, а также затрудняет работу насосов. При прочих равных условиях следует выбирать растворители, имеющие вязкость 0,5—0,7 мПа•с при температуре разделения. Безопасность работы с теми или иными растворителями определяется их воспламеняемостью и токсичностью. Практически все растворители, применяемые в ВЭЖХ, либо имеют весьма низкую температуру вспышки, либо в определенной степени токсичны. Поэтому помещение, в котором проводят работы по жидкостной хроматографии, должно иметь эффективную приточно-вытяжную вентиляцию. На рабочем месте недопустимы плохо продуваемые и застойные зоны, так как в них могут накапливаться пары растворителей, имеющие большую плотность чем воздух. Нижний предел взрываемости многих растворителей составляет 1—2%, поэтому в застойных зонах возможно образование взрывоопасной смеси. Во всех случаях следует выбирать наименее пожароопасные и токсичные растворители, руководствуясь соответствующими данными, приведенными в приложении. Так, диэтиловый эфир можно заменить диизопропиловым, а бензол — толуолом практически без ущерба для разделения. С нашей точки зрения, токсичность является более важным фактором, чем пожароопасность. При хорошей организации рабочего места и тщательном соблюдении правил техники безопасности опасность загорания практически исключена, а контакта с растворителем полностью избежать невозможно. Многие ароматические и хлорсодержащие растворители обладают способностью накапливаться в организме человека. По последним данным, некоторые из них, считавшиеся ранее малотоксичными (хлороформ, тетрахлорэтилен) являются канцерогенами, поэтому работа с этими растворителями требует осторожности. Следует отметить, что ПДК необходимо рассматривать с учетом температуры кипения растворителя: хотя метиленхлорид и хлорбензол имеют одинаковую ПДК (50 мг/м3), но при прочих равных условиях в случае низкокипящего метиленхлорида эта величина достигается значительно легче, чем для хлорбензола. Температура кипения — менее существенный фактор, чем характеристики, рассмотренные выше. Ее следует учитывать в основном в двух аспектах: в надежности работы насосов и детекторов и легкости выделения вещества из элюата. Низкокипящие растворители часто образуют пузырьки в насосах и детекторах. При использовании наиболее распространенных в настоящее время плунжерных насосов вероятность образования пузырьков тем больше, чем выше давление паров растворителя и скорость плунжера в фазе всасывания. Наличие пузырьков в насосе резко снижает точность подачи растворителя, а пузырьки в детекторе вызывают сильный шум и нестабильность нулевой линии. Для предотвращения этого явления проще всего применять растворители, температура кипения которых по крайней мере на 20—50.°Свыше комнатной. С другой стороны, при необходимости препаративного выделения вещества нецелесообразно использовать высококипящие растворители. Смешиваемость с другими растворителями необходимо учитывать при работе в режиме градиентного элюирования и при подготовке анализируемого образца с использованием предварительного экстракционного разделения. Следует помнить, что подвижная фаза в ВЭЖХ всегда должна быть гомогенной. Однако такие важные полярные растворители, как метанол и ацетонитрил, ограниченно смешиваются с гексаном. Для расширения диапазона концентраций, соответствующих гомогенным смесям, гексан заменяют на циклогексан или изооктан. Полная смешиваемость в подобных системах достигается заменой полярного компонента на этанол или изопропанол.