Рассмотрим это важнейшее уравнение более подробно. Если, α=1, то разрешение равно 0, т.е. разделения нет независима от числа теоретических тарелок в колонке. Однако из характера функции α в уравнении видно, что небольшие изменения могут привести к заметному увеличению разрешения, особенно для тех случаев, когда значения α близки к 1. Если за счет подбора условий разделения удается изменить α с 1,1 до 1,2, это приводит к улучшению разрешения в два раза. Таким образом, на фактор селективности следует обращать основное внимание при подборе условий разделения, учитывая различие во взаимодействии разделяемых компонентов как в неподвижной, так и в подвижной фазе. В отличие от газовой хроматографии, в которой взаимодействия в подвижной (газовой) фазе незначительны и селективность системы в основном определяется только взаимодействиями веществ с неподвижной фазой, в жидкостной хроматографии подвижная (жидкая) фаза не является инертной, а может играть главную роль в процессе термодинамического распределения между неподвижной и подвижной фазами вследствие селективного взаимодействия разделяемых веществ с подвижной фазой. Поэтому в выборе условий для высокоселективного разделения как выбор сорбента, так и выбор растворителя играют одинаково важную роль, а искусство хроматографиста в ВЭЖХ более многогранно и требует учета большего числа взаимодействий между молекулами, чем в ГХ.

Второй сомножитель в уравнении принимает значение, равное 0 (при этом разрешение также равно 0, т.е. разделение отсутствует) в том случае, когда коэффициент емкости для второго компонента равен 0, т.е. оба разделяемых компонента элюируются как несорбируемые вещества (взаимодействие с неподвижной фазой отсутствует). С ростом значения k' разрешение увеличивается, при этом скорость анализа падает.

Наконец, из третьего сомножителя видно, что достигаемое разрешение пропорционально корню квадратному из числа теоретических тарелок, т.е. для увеличения разрешения вдвое нужно увеличить эффективность колонки в 4 раза (например, использовать колонку в 4 раза длиннее). Удлинение колонки в 4 раза приводит к увеличению продолжительности анализа также вчетверо, т. е. скорость анализа падает. Как правило, если эффективность колонки недостаточна, а скорость анализа является важным фактором, идут по другому пути для повышения эффективности — используют колонку с более мелким по зернению сорбентом. Однако в этом случае платой за большую эффективность при той же скорости анализа является повышение давления на колонке.

Следует отметить, что, хотя из уравнения и очевидно, что эффективность колонки меньше влияет на разрешение, чем ее селективность и коэффициент емкости, так как разрешение пропорционально корню квадратному из эффективности, тем не менее повышению эффективности колонок придается большое значение и уделяется огромное внимание как производителями колонок, так и их потребителями. Это связано с тем, что для сложных многокомпонентных смесей, особенно смесей неизвестного состава, часто не удается подобрать условия так, чтобы селективность была высокой для всех компонентов. В этом случае высокая эффективность колонки позволяет добиться разделения для пар веществ с небольшим значением α.

1.2 РАЗМЫВАНИЕ В КОЛОНКЕ И ВНЕ ЕЕ

Вещества вводятся в колонку в виде узкой зоны, которая по мере ее движения с подвижной фазой по колонке становится все шире, т. е. размывается в результате диффузионных процессов. Мерой этого размывания в колонке является высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ). Установлено, что размывание полосы в хроматографической колонке обусловлено тремя причинами: наличием вихревой диффузии, молекулярной диффузии и сопротивления массопередаче. Общая ВЭТТ (H) колонки получается путем суммирования вкладов всех этих факторов, вызывающих размывание хроматографической зоны:

H = Hp + Hd + Hs + Hm,

где Нр — вклад в размывание вихревой диффузии; На — вклад в размывание молекулярной диффузии; Hs — вклад, связанный с сопротивлением массопередаче в неподвижной фазе; Нт — вклад, связанный с сопротивлением массопередаче в подвижной фазе.

Не вдаваясь в подробное рассмотрение этих вкладов в ВЭТТ, тем не менее следует заметить, что чем меньше каждое из четырех слагаемых, тем меньше будет и суммарное значение ВЭТТ и, следовательно, эффективнее колонка. Величина Нр пропорциональна диаметру частиц сорбента и уменьшается с улучшением равномерности заполнения

Рис. 1.4. Зависимость ВЭТТ от скорости подачи растворителя (V, мл/мин).

Вклад в размывание пика разных факторов колонки сорбентом. Величина Hd растет при использовании очень малых скоростей потока, при обычно используемых высоких скоростях Hd настолько мала, что ею можно пренебречь. Величина Нm уменьшается при ускорении процессов адсорбции — десорбции в неподвижной фазе, т. е. при использовании частиц малого размера и тонких пленок неподвижной фазы, при уменьшении скорости потока. Величина Нm уменьшается при уменьшении размера частиц (пропорционально квадрату диаметра частиц), более равномерном и плотном заполнении колонки сорбентом, менее вязком растворителе, меньших скоростях потока.

Если изобразить графически зависимость ВЭТТ от скорости подачи растворителя, то она будет иметь вид, изображенный на рис.1.4. На нем можно видеть и оценить вклад каждой из составляющих в значение ВЭТТ.

Таким образом, размывание в колонке уменьшается и эффективность повышается, когда используют более мелкий сорбент, более равномерный по составу (узкая фракция), более плотно и равномерно упакованный в колонке, при использовании более тонких слоев привитой фазы, менее вязких растворителей и оптимальных скоростей потока.

Однако наряду с размыванием полосы хроматографической зоны в процессе разделения в колонке может происходить также и размывание ее в устройстве для ввода пробы, в соединительных капиллярах инжектор — колонка и колонка — детектор, в ячейке детектора и в некоторых вспомогательных устройствах (микрофильтры для улавливания механических частиц из пробы, устанавливаемые после инжектора, пред-колонки, реакторы-змеевики и др.). Размывание при этом тем больше, чем больше внеколоночный объем по сравнению с удерживаемым объемом пика. Имеет также значение и то, в каком месте находится мертвый объем: чем уже хроматографическая зона, тем большее размывание даст мертвый объем. Поэтому особое внимание следует уделять конструированию той части хроматографа, где хроматографическая зона наиболее узкая (инжектор и устройства от инжектора до колонки) — здесь внеколоночное размывание наиболее опасно и сказывается наиболее сильно. Хотя считается, что в хорошо сконструированных хроматографах источники дополнительного внеколоночного размывания должны быть сведены до минимума, тем не менее каждый новый прибор, каждая переделка хроматографа должны обязательно заканчиваться тестированием на колонке и сравнением полученной хроматограммы с паспортной. Если наблюдается искажение пика, резкое снижение эффективности, следует тщательно проинспектировать вновь введенные в систему капилляры и другие устройства. Размывание вне колонки и его неправильная оценка могут привести к значительной (более 50%) потере эффективности, особенно в тех случаях, когда относительно давно сконструированные хроматографы пытаются использовать для высокоскоростной ВЭЖХ, микроколоночной ВЭЖХ и других вариантов современной ВЭЖХ, требующих микроинжекторов, соединительных капилляров с внутренним диаметром 0,05-0,15 мм минимальной длины, колонок вместимостью 10-1000 мкл, детекторов с микрокюветами емкостью 0,03-1 мкл и с высоким быстродействием, высокоскоростных самописцев и интеграторов.