На практике, в зависимости от задачи чаще всего используют градиенты сахарозы 5—20% и 15—30%. Устройство для создания линейного градиента концентрации сахарозы аналогично тому для создания градиента пористости ПААГ. Отличие в том, что по причине большой вязкости растворов сахарозы вместо магнитной мешалки используют вращающуюся в стакане смесителя винтообразную полоску, изготовленную из подогретого плексигласа, которая гонит жидкость вверх (рис. ).

Рис.

Материал полиалмерных и поликарбонатных пробирок плохо смачивается водой. Поэтому подавать жидкость в пробирку по стенке неудобно — она будет скатываться каплями, нарушая плавность градиента. Лучше, как это показано на рисунке, подавать раствор сахарозы через длинную иглу на дно пробирки. В смеситель в этом случае заливают раствор сахарозы минимальной концентрации, а в резервуар — максимальной. Более плотный раствор сахарозы будет плавно оттеснять кверху менее плотные слои.

В некоторых случаях, например, когда желательно, чтобы крупные частицы, приближаясь ко дну пробирки, не только не увеличивали бы скорость своего движения, а, наоборот, уменьшали ее, имеет смысл подобрать нелинейный, круто нарастающий ко дну пробирки градиент концентрации сахарозы. Так, чтобы совместное влияние роста плотности и особенно вязкости среды центрифугирования оказались сильнее, чем эффект увеличения радиуса вращения. Этого можно достигнуть, если диаметр смесителя сделать больше диаметра резервуара. При заполнении пробирки сумма объемов жидкости в обоих стаканах должна быть использована полностью. Сначала небольшие добавки плотной сахарозы из резервуара, разбавляясь в большом объеме жидкости в смесителе, будут лишь незначительно увеличивать начальную плотность раствора. Тем не менее, в конце заполнения пробирки плотность раствора в ней все равно достигнет максимального значения — градиент окажется медленно нарастающим в верхней части пробирки и крутым у ее дна.

Извлечение и определение разделившихся зон после окончания центрифугирования (поскольку они не окрашены) приходится делать «на ощупь». Проще всего, — так оно и делалось поначалу, — закрепив открытую пробирку в зажиме вертикально, проколоть ее дно иглой от шприца и собирать фракции по определенному числу капель в последовательный ряд пробирок, установленных в штативе, который самому экспериментатору и передвигать своевременно. Способ нехорош не только тупой трудоемкостью, но и изменением объема капель по мере опорожнения пробирки. Лучше к игле присоединить тонкую полиэтиленовую трубочку, а ее к перистальтическому насосу (будет описан в следующей главе) с заданной скоростью откачивания жидкости. От насоса подавать выбранное количество капель в пробирки, установленные в «коллектор фракции». Последний представляет из себя механический прибор, где порядка 100-150 пробирок поочередно, автоматически, — через заданные интервалы времени или после отсчета заданного числа капель, подводятся под капельницу, которой заканчивается трубочка, идущая от насоса.

Можно пробирку и не прокалывать, а иглу осторожно опустить сверху до дна пробирки и таким образом пофракционно отсасывать ее содержимое. В любом случае обнаружение разделенных зон осуществляется последовательной проверкой всех пробирок на ультрафиолетовое поглощение: на длине волны 280 тц для белков и 260 тц — для нуклеиновых кислот. Фракции, обнаружившие искомое содержимое, объединяются.

В качестве интересного для нас примера использования центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, я выбрал исторические опыты Оказаки (1971 год), положившие основу современным представлениям о механизме редупликации ДНК. В этих опытах бактерии, растущие в жидкой питательной среде, получали через эту среду импульсную метку радиоактивным тимидином длительностью от 2 секунд до 2-х минут (в разных опытах). По окончании импульса бактерии быстро охлаждали, выделяли суммарную ДНК и центрифугировали ее в щелочном (для полной денатурации ДНК) градиенте 5-20% сахарозы в бакет-роторе на скорости 25 тыс. об/мин в течение 16 часов. После раскапывания градиента содержание новосинтезированной ДНК в каждой фракции оценивали по радиоактивности (в жидком сцинтилляторе — см. главу 15).

Далее происходит перераспределение метки между «свободными» (отделившимися в ходе выделения ДНК) фрагментами Оказаки и крупными фрагментами зрелой ДНК, лежащими в диапазоне 20—60 S. В эти последние преходит и часть радиоактивности, находившейся во фрагментах Оказаки, после их включения в состав комплементарной нити ДНК. Так что для кривых 5 и 6 относительная доля включения метки во фрагменты Оказаки и зрелую ДНК существенно изменяется.

Равновесное ультрацентрифугирование

Идея метода состоит в создании такого градиента по длине пробирки (в бакет-роторе), чтобы плотность среды центрифугирования у дна была больше, чем у наиболее плотных частиц, а у мениска — меньше, чем у наименее плотных. При достаточно длительном центрифугировании частицы будут перемещаться вдоль градиента до тех пор, пока не достигнут положения, в котором плотность среды равна их плавучей плотности. Движение прекращается, частицы различной плотности располагаются в разных участках градиента. Таким образом, осуществляется фракционирование частиц по их плотности.

Такое разделение имеет следующие особенности:

1. Размеры частиц и их массы не будут сказываться на окончательном распределении. Положение на градиенте будет определяться только плотностью частиц.

2. Движение частиц к положению равновесия будет происходить как из области более низкой плотности градиента, чем их плавучая плотность, так и из области более высокой плотности. Таким образом наряду с седиментацией будет происходить и флотация. Это означает, что нет необходимости наносить тонкий начальный слой препарата на жидкость, заполняющую пробирку. Можно даже весь препарат смешать с полным объемом градиентной среды.