5.2. Одним из вариантов применения лактонной пробы является гравиметрический метод. Несмотря на несомненное достоинство — высокую точность, сравнимую со спектрофотометрическим определением, — он не получил широкого применения из-за трудоемкости и длительности.

5.3. Имеются литературные данные о применении перманганатометрии при количественном определении кумарина, однако этот метод дает недостаточно точные результаты.

5.4. Кислотные свойства природных гидроксикумаринов были изучены при помощи метода потенциометрического титрования в воде и некоторых неводных растворителях. Влияние строения кумаринов на характер кривых потенциометрического титрования позволяет использовать последние для установления структуры соединений наряду со спектрами их поглощения.

5.5. Колориметрические методы количественного определения кумаринов.

К спиртовому извлечению прибавляют 10% спиртовой раствор КОН, нагревают – раствор желтеет, прибавляют свежеприготовленный диазореактив (смесь равных объёмов пара-нитроанилина и раствора нитрита натрияв концентрированной НСl) при наличии кумаринов раствор приобретает окраску от коричневой до вишнёвой. Данный метод был применен для анализа кумаринов Heracleum sp., бергаптена в плодах Pastinaca sativa L., псоралена в субстанции и лекарственных препаратах, атамантина в корнях Peucedanum oreoselinum L. (Moench.), ксантотоксина и бергаптена в плодах Ammi majus L. и в препарате "Аммифурин".(11) (2):

5.6 Имеются данные о применении фотоколориметрического метода для количественного определения синтетического антикоагулянта синкумара. Однако необходимо отметить, что реакция азосочетания не является специфичной для кумаринов и их производных (сходные эффекты способны давать фенолы, ароматические амины и флавоноиды). Перед проведением фотоколориметрии необходима тщательная очистка от сопутствующих веществ. Кроме того, диазопроизводные кумаринов имеют различия в спектрах поглощения, обусловленные спецификой строения исходного вещества.

5.7 Спектрофотометрический метод основан на способности кумаринов к поглощению в УФ-области спектра. Показано, что основные полосы поглощения в спектрах кумаринов и фурокумаринов обусловлены переходами 7г-электронов со связанных молекулярных орбиталей на разрыхляющие. Наличие нескольких характерных полос высокой интенсивности в диапазоне 220 - 350 нм позволяет использовать УФ-спектрофотометрию для количественного определения содержания кумаринов. Характерные максимумы поглощения приведены, в частности, в работах отечественных исследователей.

Из групповых методов анализа кумаринов УФ-спектрофотометрический метод является наиболее перспективным, т.к. позволяет проводить компонентный анализ на основе различий спектров поглощения, не требует предварительного разделения и относительно прост в аппаратурном оформлении. Однако при его применении желательно наличие стандартных образцов, позволяющих более точно, чем в случае использования калибровочных графиков и удельных показателей поглощения, устанавливать содержание целевых компонентов.

Методом УФ-спектрофотометрии установлено, что в спектрах поглощения синтетических антикоагулянтов — дикумарина, фепромарона и синкумара — наблюдаются две характерные полосы в области 280 и 306 нм, первая из которых имеет колебательную природу, а вторая соответствует р-п-сопряжению бензольного и пиронового циклов.

5.8 Прямая спектрофотометрия при длине волны 352 нм с использованием рабочего стандартного образца ксантотоксина была предложена для оценки качества препарата "Аммифурин". Совместное применение ТСХ и спектрофотометрии делает методику более точной. Возможно использование ТСХ на силикагеле КСК254 5/40 в системе петролейный эфир — этилацетат (1:1), после элюирования пятен этиловым спиртом определяется оптическая плотность. Применим аналогичный метод с использованием бумажной хроматографии на бумаге, импрегнированной метанольным раствором формамида в системе растворителей гептан - бензол (4:1). В работе рассмотрена возможность проведения количественного определения пеуцеданина в растительном сырье и препарате с использованием ТСХ на пластинке с незакрепленным силикагелем в системе петролейный эфир — диэтиловый эфир (1:2). Элюирование пятен осуществляют этанолом. При длине волны 298 нм проводят определение удельного показателя поглощения вещества, который используют для расчета его содержания. Существенным преимуществом применения спектрофотометрии в данном случае стала возможность определения примеси ореозелона, поглощающего при 345 нм. Количественное содержание птериксина в корнях Libanotis densiflora и в препарате "Либоверин" предложено определять по следующей методике: ТСХ на силикагеле КСК в системе н-гексан — бензол — метанол (5:4:1), элюирование пятен этиловым спиртом и измерение оптической плотности элюата при длине волны 322 нм. Расчет проводят по удельному показателю поглощения птериксина.

5.9 Хроматоспектрофотометрические методики разработаны также для определения количественного содержания псоралена и суммы фурокумаринов в плодах Psoralea drupacea Bge. с использованием стандартных образцов псоралена и ангелицина. С использованием удельного показателя поглощения ксантотоксина возможен и спектрофотометрический метод оценки качества плодов Pastinaca sativa L

Псорален и бергаптен в препарате "Фурален" можно определить количественно, без разделения суммы кумаринов, при длине волны 297,5 нм, либо при двух длинах волн. Последний принцип положен в основу анализа листьев Ficus carica L., субстанции псоберана и его препаратов. Предложенный метод основан на модификации хроматоспектрофотометрического метода: при 298 нм определяется сумма фурокумаринов, а при 246 и 268 нм, где наблюдается наибольшая разность в интенсивности поглощения — содержание псоралена. Количество бергаптена определяется по разности. В качестве стандартного образца используется псорален.

При помощи УФ-спектрофотометрии возможно также определение молекулярной массы кумаринов и фурокумаринов. УФ-спектры могут быть использованы как один из методов идентификации выделенных из растения кумаринов, а также при исследовании их физиологической роли. Описано использование данного метода для оценки биодоступности дикумарола.

5.10 Полярографический метод применяется для анализа готовых лекарственных форм фурокумаринов и обусловлен их восстановлением на ртутно-капельном электроде в а-пироновом кольце по двойной связи в положении 3,4. На основании изучения физико-химических свойств природных кумаринов предложены методики качественного, количественного и функционального анализа, которые вошли в фармакопейные статьи на келлин, псорален, виснадин, пастинацин, некоторые виды лекарственного растительного сырья и лекарственные формы. В частности, для контроля качества плодов Pastinaca sativa L. были использованы полярографический и хроматополярографический методы с использованием стандартного образца ксантотоксина. При сочетании полярографии и хроматографии изучался химический состав кумаринов ряда растений и природных продуктов. Имеются литературные данные о методике количественного определения кумарина и коричной кислоты, применяемых в качестве стабилизаторов в инъекционном растворе ФиБС. Несомненным достоинством метода является возможность быстро и точно анализировать сумму кумаринов без предварительного выделения отдельных компонентов, однако следует учитывать, что из-за высокой чувствительности к электрохимически активным примесям требуется тщательная предварительная подготовка.