Предварительная подготовка образца и его ввод в хроматограф

Перед анализом микропримесей для повышения чувствительности желательно провести концентрирование соединения методами, описанными в соответствующем разделе. Предпочтительно применять оборудование, позволяющее проводить автоматическую предварительную обработку образца, в том числе экстрагирование, измельчение, фильтрацию и автоматический ввод в хроматограф.

Для получения высокой чувствительности нужно вводить максимально возможный объем образца. При работе в изократическом режиме на высокоэффективных аналитических колонках оптимальный объем образца составляет от 100 до 500 мкл. Ввод большого объема разбавленного образца позволяет компенсировать относительно низкую чувствительность некоторых детекторов для жидкостной хроматографии.

При небольших количествах образца анализ проводят на колонках с внутренним диаметром 1–2 мм, что уменьшает его расход. Используя в качестве растворителя пробы слабый растворитель, можно наносить на колонку большие объемы образца. При этом он накапливается на входе в колонку, так как к' для компонентов образца велико и в колонке происходит концентрирование микропримесей, что значительно повышает чувствительность обнаружения. Пользуясь этим приемом, можно обнаружить некоторые малополярные органические соединения, например ароматические углеводороды, присутствующие в виде микропримесей в сточных водах, на колонке с обращенной фазой.

Для обеспечения наибольшего концентрирования растворитель пробы должен быть по возможности слабым, например, содержать 90–95% воды. В дальнейшем для элюирования пробы силу подвижной фазы резко увеличивают. Концентрирование на колонке позволяет в некоторых случаях вводить 1 л и более образца при конечном объеме зоны интересующего нас вещества менее 50 мкл (градиентное элюирование), т.е. концентрировать вещество в 20 000 раз. Можно повысить чувствительность обнаружения, проводя концентрирование образца и вне колонки, например, выпаривая растворитель. Однако надо быть уверенным, что при этом не происходит потеря или видоизменение примесей. Кроме того, при таком процессе значительно повысится содержание основных компонентов в образце, что приведет к перегрузке по ним колонки и затруднит анализ. Вещества, удерживаемые сильнее, чем примеси, могут быть после анализа, удалены из колонки не только за счет повышения силы растворителя, но и путем обратной промывки колонки.

Разрешающая способность колонки

Иногда удается провести разделение на обращенной фазе таким образом, что основные компоненты образца элюируются со временем, близким к t0, а микропримеси удерживаются на колонке, что облегчает их количественное определение. Оценка содержания микропримеси наиболее надежна, когда ее пик регистрируется до пика преобладающего в образце компонента. Элюирование пика микропримеси на хвосте преобладающего компонента сильно ухудшает ее количественное определение. Любое хроматографическое разделение на колонке приводит к разбавлению образца. При анализе микропримесей возникает проблема разделения при минимальном разбавлении. Степень разбавления введенного образца может быть выражена уравнением

С макс/С0 = VsN0,5/[Vr(2π)0,5],

где Смакс – Концентрация, соответствующая максимуму пика; С0 – исходная концентрация в образце; Vs – вводимый объем; N – число теоретических тарелок для данной колонки; Vr – удерживаемый объем микропримеси.

Из уравнения видно, что снижения степени разбавления. а значит, увеличения чувствительности определения микропримеси можно достигнуть за счет увеличения вводимого объема, ^использования колонки с большим числом теоретических тарелок или за счет снижения объема удерживания микропримеси. К увеличению N ведет применение эффективных колонок, заполненных частицами с размером менее 10 мкм. При анализе микропримесей желательно применение коротких колонок (5–10 см) с размером частиц 3–5 мкм.

Большое влияние при анализе микропримесей оказывает изменение селективности системы и повышение коэффициента разделения а, что достигается изменением состава подвижной фазы и выбором оптимального хроматографического режима. Кроме того, как видно из уравнения

Cмакc/С0 =(α–1)/α

изменение селективности может значительно снизить степень разбавления пика.

Детекторы

При анализе микропримесей работают с селективными детекторами, чувствительными к интересующему веществу. Предельная чувствительность детектора зависит от отношения сигнала к шуму самого детектора и от его способности реагировать на микропримеси в образце. Перед выполнением анализа необходимо эти микропримеси идентифицировать. Наиболее часто при анализе микропримесей применяют высокочувствительные фотометрические детекторы, работающие в УФ-области, и спектрофотометры. УФ-фотометры, имеющие чувствительность более 0,002 е.о.п. на всю шкалу при шуме 1%, позволяют обнаруживать нанограммовые количества веществ, умеренно поглощающих в УФ-области, а флуориметры – даже пикограммовые. Для достижения максимальной чувствительности желательно работать при длине волны, соответствующей максимуму поглощения в УФ-спектре вещества. Получение соответствующих производных после колонки повышает селективность анализа и позволяет проводить его при максимальной предварительной очистке образца.

Примеси, способные к окислению или восстановлению в электролите, наиболее целесообразно определять чувствительными электрохимическими детекторами.

Калибровочные графики

При количественном анализе микропримесей не так важна высокая точность измерений, как их надежность, что достигается получением зон, свободных от посторонних соединений. Так как точность около 10% считается вполне удовлетворительной, пики можно оценивать по их высоте, меньше зависящей от четкости отделения микропримеси от соседних зон, пики которых могут накладываться на пики анализируемых микропримесей. Хотя оценка по площадям пиков более точна, калибровка по высоте пиков удобнее.

В ВЭЖХ калибровочные графики микропримесей обычно линейны и проходят через начало координат. Чтобы избежать возможных частичных потерь образца, проводят калибровку методом внутреннего стандарта (по соотношению высот пиков), причем внутренний стандарт известной концентрации добавляют до предварительной обработки образца. В этом случае потери учитывают за счет эквивалентного изменения концентрации внутреннего стандарта и образца. Стандартный образец, близкий по свойствам микропримеси, добавляют, когда трудно выделить анализируемое вещество в чистом виде, чтобы построить калибровочный график. Подробнее калибровка по методу внутреннего стандарта рассмотрена в гл. 10.

При анализе сложных смесей, в частности в тех случаях, когда наблюдаются эффекты влияния матрицы или когда получение в чистом виде исходного образца, для которого строится калибровочный график, затруднительно, применяют метод добавления стандарта. Наличие других компонентов в образце может влиять на степень удерживания и (или) высоту пика интересующего вещества. Метод добавления стандарта состоит в следующем. Образец разделяют в хроматографе и измеряют высоту hx интересующего нас пика. После этого добавляют известное весовое количество Wx вещества Х и повторяют разделение, определяя высоту пика h'x вещества X. Для вещества Х строят калибровочный график и, определив калибровочный коэффициент Sx=(h'x–hx)/Wx, вычисляют количество вещества Х в исходном образце как hx/Sx. Для проверки линейности графика берут несколько значений Wx. Метод добавления стандарта не обеспечивает поправки на нестабильность базовой линии, на помехи со стороны других компонентов и т.д. Эти помехи должны быть выявлены до добавления стандарта.