Хроматографист, начинающий работать в области высокоэффективной жидкостной хроматографии, должен ознакомиться с основами качественного анализа. Качественный анализ применяют для идентификации известного продукта, полученного новым путем или находящегося в смеси с другими продуктами. Он необходим при выделении из сложных биологических, химических смесей различных компонентов, что особенно важно в медицине, криминалистике, экологии, для контроля за нахождением некоторых лекарств и химических продуктов и их метаболитов в биоматериалах. Знакомство с основами качественного анализа поможет избежать типичных ошибок, например, отличить примеси в образце от примесей в растворителе или проверять чистоту вещества не на одной длине волны спектрофотометра, а на разных и т.д.

Прежде чем приступить к анализу, необходимо установить, весь ли образец элюируется из колонки данной системой растворителей или нет. Чтобы быть уверенным в полном элюировании, необходимо собрать всю вытекающую из колонки жидкость, упарить растворитель, взвесить остаток и найти степень извлечения образца.

Идентификацию компонентов в ВЭЖХ можно проводить тремя способами: 1) использовать информацию об удерживании; 2) исследовать зоны, полученные при разделении в колонке жидкостного хроматографа, методами спектрального или химического анализа; 3) непосредственно подключить спектральный анализатор к колонке.

Для регистрации пиков в хроматографии используют удерживаемый объем VR или время удерживания tR. Обе величины являются характеристикой вещества в данной хроматографической системе. Так как время удерживания разделяемого вещества состоит из времени взаимодействия в колонке и времени прохождения пустых участков трубки, оно меняется от прибора к прибору. Удобно иметь вещество, не удерживаемое данной колонкой, приняв его за стандарт, время и объем удерживания которого t0, V0. Хроматографирование вещества и стандарта необходимо проводить при одних и тех же условиях (давлении и скорости потока). Поправку на мертвый объем можно учесть, используя исправленное время удерживания tn или исправленный объем удерживания VR, по формуле

tR’=tR — t0

При идентификации по данным об удерживании, известные индивидуальные вещества, которые могут присутствовать в образцах, разделяют в той же самой хроматографической системе, и для них получают значения tR. Сравнивая эти значения tR с временем удерживания неизвестного пика, можно обнаружить, что они либо совпадают, и тогда вероятно, что пики соответствуют одному и тому же веществу, либо tR известного вещества не соответствует tR неизвестной зоны. Тогда все же возможна ориентировочная оценка значений tR веществ, не доступных для непосредственного измерения степени их удерживания. Рассмотрим оба варианта.

В первом случае, очевидно, необходимо предварительное изучение образца для постулирования присутствия в нем конкретных веществ. При работе с простыми смесями нетрудно определить, совпадает ли степень удерживания зон образца и известных веществ, или нет, т. е. значения tR одинаковы или различаются. В случае сложных смесей сразу несколько веществ могут элюироваться со схожими значениями tR, и реально получаемые при хроматографическом разделении зоны перекрываются. В результате получение точных значений tR для различных зон становится невозможным. Надежность идентификации возрастает при повышении разрешающей способности, более тщательном контроле условий разделения, многократном измерении значений tR и усреднении найденных величин. При этом хроматографическое разделение известного и неизвестного веществ должно чередоваться. При разделении сложных смесей значение tR вещества может изменяться под влиянием матрицы самого образца. Такое воздействие возможно в начале хроматограммы и при перекрывании пиков; возможно также затягивание зон, о чем уже упоминалось.

В подобных случаях следует добавить стандарт к образцу в соотношении 1:1. Если вещества идентичны, значение tR исходного вещества не изменится, и на хроматограмме получают только один пик. Если имеется прибор с циклической системой хроматографирования, то для надежности идентификации желательно смесь пропускать через колонку несколько раз.

Сведения о степени удерживания можно найти и в литературе, однако ценность этой информации ограничена. Так как колонки даже одной партии дают плохую воспроизводимость, литературные значения не всегда соответствуют истинному значению tR на данной колонке. Для адсорбционной хроматографии возможно, однако, предсказание tR на основании литературных данных. Другая трудность, связанная с использованием литературных значений tR,—сложность их поиска в специальной литературе, хотя библиографические обзоры, публикуемые в Jornal of chromatography, имеют обновляемый указатель по типам веществ.

Во втором случае, когда времена удерживания известных соединений и зон образца не совпадают, имеется возможность предсказать время удерживания неизвестного компонента. Вполне надежны предсказания относительного удерживания на основании данных о структуре в пространственно-эксклюзионной хроматографии. Менее точны они в адсорбционной, распределительной хроматографии и особенно при работе на химически привязанной фазе. Для ионной и ион-парной хроматографии веществ с известной р Ка возможны лишь приблизительные определения значений tR. Всегда легче предсказать относительное удерживание или значение α, чем абсолютные значения k’. Относительные значения tR легче оценить для родственных соединений или производных, например замещенных алкилкарбоновых кислот или производных бензола.

При изократическом разделении гомологов или олигомеров иногда наблюдается следующая закономерность:

lgk'=A+Bn,

где A и В — константы для ряда выбранных образцов и для данной хроматографической системы (на одной и той же колонке, с такой же подвижной и неподвижной фазами); n—число одинаковых структурных единиц в молекуле образца.

В градиентном режиме при линейном изменении силы подвижной фазы уравнение приводится к виду

tR =A'+B'n,

т. е. значения tR линейно изменяются с изменением n.

Введение в молекулу образца функциональной группы j будет приводить к изменению k' в первом уравнении на некоторый постоянный коэффициент αj в данной хроматографической системе. Можно получить групповые константы αj для различных замещающих групп j, значения которых будут возрастать при увеличении полярности функциональных групп, во всех видах хроматографии, кроме обращенно-фазной, где значения констант будут уменьшаться с увеличением полярности.

Некоторые групповые константы а для различных замещающих групп j приведены в табл. 1.

В адсорбционной хроматографии первое уравнение не всегда применимо, так как оно справедливо при условии, что все изомеры имеют одно и то же значение k', что не всегда соблюдается. Можно, однако, построить график зависимости lgk/ одних и тех же соединений на одной колонке относительно lgk' тех же соединений, но на другой колонке или относительно соответствующих характеристик в тонкослойной хроматографии, например, lg[(1—Rf)/Rf], и при этом обычно получают линейную зависимость.