Ионообменное, разделение обычно выполняют при применении водных растворов солей, которым придаются буферные свойства. Иногда добавляют в подвижную фазу небольшое количество смешивающихся с водой органических растворителей – метанола, этанола, ацетонитрила, тетрагидрофурана. Сила и селективность растворителя зависят от типа и концентрации буферных ионов и других солей, от значения рН и от вида и концентрации добавленных органических растворителей.

Удерживание в ионообменной хроматографии зависит от двух процессов: распределения образца между водной подвижной фазой и органической неподвижной и образования ионных пар (т.е. анионного или катионного обмена), причем последний процесс доминирует.

Распределение вещества между фазами зависит от силы электростатического взаимодействия заряженных ионизированных групп вещества с заряженными группами ионообменника. Некоторые гидрофобные соединения или вещества, способные образовывать водородные связи, могут взаимодействовать с материалом матрицы неспецифически.

Степень удерживания образца снижается с увеличением ионной силы подвижной фазы и увеличивается с увеличением ионообменной емкости сорбента. Ионная сила подвижной фазы возрастает при возрастании концентрации буфера и сохранении неизменным рН или при добавлении соли. Важна также концентрация буферных растворов, так как в растворе наблюдается конкуренция между ионами образца и буфера. Уменьшение концентрации буферного раствора увеличивает сродство смолы к образцу, что приводит к увеличению времени удерживания. Концентрация буферного раствора колеблется от 0,001 до 6 моль/л, причем верхняя граница определяется растворимостью соли, используемой в качестве буфера, а нижняя – самой буферной силой, так как в слабом буферном растворе нельзя контролировать уровень рН. Сильных буферных растворов также следует избегать, так как возможно выпадение осадка и забивание колонок. Сила растворителя зависит от типа противоиона, причем степень удерживания образца увеличивается в ряду, обратном ряду активности ионов, приведенному выше.

При анализе рН раствора выбирают таким образом, чтобы молекула образца была полностью ионизирована, обычно для кислот рН≅рКα+1,5, а для оснований рН≅рКα+1,5. Изменение рН подвижной фазы влияет на удерживание образца. Оно с повышением рН увеличивается при анионообменном разделении и уменьшается при катионообменном, т.е. происходит уменьшение силы растворителя при анионном и увеличение при катион-ном обмене. Особенно сильно влияет изменение рН раствора, происходящее вблизи значений рКα образца.

В ионообменной хроматографии применяют следующие буферные растворы: ацетатный, фосфатный, цитратный, формиатный, аммиачный, боратный. Селективность разделения в ионообменной хроматографии зависит от концентрации и вида буферных ионов и органических растворителей, а также от рН среды. Ионообменное разделение проходит в пределах температур от комнатной до 60 °С. Чем выше температура, тем меньше вязкость подвижной фазы и тем эффективнее разделение. Однако при высокой температуре стабильность колонки или образца может быть нарушена. Многие ионо-обменники выдерживают температуру до 60 °С, а некоторые полимерные катионообмен-ники – даже до 80 °С. Биохимические пробы принято разделять при низких температурах, часто при 4 °С, хотя в современной ВЭЖХ при быстрых разделениях вероятность разрушения образца при 20–30 °С резко снижается. Повышение температуры может привести к снижению k' для всех компонентов образца, а снижение ионной силы подвижной фазы может привести к обратному явлению.

Вводимые количества образца не должны превышать 5% суммарной ионообменной емкости. Так, для соединений с молекулярной массой 200–500 предполагается введение около 50 мг пробы на 1 г полимерного сорбента. Желательно, чтобы вводимый объем образца не превышал 1/3 объема первого интересующего пика.

В подвижную фазу добавляют иногда органические растворители (метанол, этанол, ацетонитрил, диоксан), действие которых аналогично добавлению растворителей в обращенно-фазной хроматографии: при увеличении их количества степень удерживания образца снижается, и этот эффект более силен для менее полярных растворителей. Добавлением органических растворителей можно добиться также изменения селективности системы. Таким образом, снижают время удерживания в ионообменной хроматографии следующие факторы: 1) повышение температуры; 2) повышение концентрации буферного раствора; 3) снижение степени ионизации вещества за счет изменения рН.

Ионная хроматография

Особым видом ионообменной хроматографии, применяемым для анализа органических и неорганических ионов, не поглощающих в УФ-области, является ионная хроматография. В этом методе ионообменное разделение ионов сочетают с кондукто-метрическим определением их. Поскольку высокочувствительное кондуктометрическое определение возможно только при невысокой фоновой электропроводности потока жидкости, поступающей в детектор, фоновый электролит подвижной фазы предварительно удаляют пропусканием его через ионообменные смолы.

Предложены два основных метода ионной хроматографии.

1. Двухколоночная ионная хроматография, основанная на компенсации (подавлении) электролита, содержащегося в элюенте для разделения смеси ионов на колонке с помощью второй ионообменной колонки, расположенной между детектором и раздели тельной колонкой. Этот метод и был ранее назван ионной хроматографией.

Вещества разделяются на катионообменной колонке 4 по ионообменному механизму, попадают в десорбционную колонку 5 со смолой в ОН-форме, где происходит нейтрализация подвижной фазы и удаление электролита из элюента. Анализируемые вещества выходят из колонки 5 в деионизиванной воде и попадают в кондуктометрическую кювету 6. Сигнал с кондуктометра 7 поступает на самописец 8 или интегратор. На аналогичной установке анализируют анионы. Так как десорбционную колонку приходится часто регенерировать, отношение объемов, пропущенных через колонку 5, к объемам, допущенным через колонку 4, должно быть меньше или равно 1O. Предложений схемы разделения для ионной хроматографии и варианты заполнения разделительной и десорбирующей колонок.

2. Другим вариантом ионной хроматографии является одноколоночная ионная хроматография, основанная на использовании электролита с невысокой электропроводностью. В этом случае компенсационная колонка отсутствует.

Метод подробно не рассматривается нами, так как имеется ряд неплохих обзоров по ионной хроматографии [17, 18].

Ионнные хроматографы от простых до полностью автоматических выпускают фирмы «Даонекс корпорейшн», «Бекман» (США) и др. В СССР ионные хроматографы серийно выпускаются Джержинским ОКБА. Методом ион-хроматографии определяют неокрашенные анионы и катионы, находящиеся в образце в виде примесей, и микроколичества вредных веществ в воде, воздухе и биологических жидкостях.

Рис. 1. Схема установки для анализа катионов методом ионной хроматографии: 1 – емкость с элюентом; 2 – насос: 3 – ввод пробы; 4 – разделительная колонка; 5 – десорбирующая колонка; 6 – кондуктометрическая кювета; 7 – кондуктометрический детектор; 8 – самописец