Интенсивность флуоресцентного излучения зависит от интенсивности возбуждающего излучения и квантового выхода процесса возбуждения. Поэтому для повышения чувствительности метода следует использовать достаточно мощные источники света, например газоразрядные лампы или лазеры. Применение лазеров позволяет детектировать количество вещества на уровне 10-12 г. Метод двухфотонного лазерного возбуждения отдает возможность использовать лазер с более низкой энергией, например, аргоновый. Для внедрения в практику такого метода необходимо иметь достаточно широкий спектр лазеров, перестраиваемых по длинам волн. Чувствительность детекторов по флуоресценции для некоторых соединений оказывается на несколько порядков выше чувствительности детекторов по поглощению, поскольку отсчет удается вести фактически от интенсивности регистриpyeмогo излучения, близкой к нулю, на которую не накладывается возбуждающее излучение.

Разработаны детекторы, которые могут одновременно работать и как спектрофотометры и как флуориметры. Детекторы с монохроматорами, позволяющими выбрать необходимые длины волн для возбуждающего и флуоресцентного излучения, обеспечивают высокую чувствительность и селективность, однако они оказываются значительно более дорогими, чем флуориметры с постоянной спектральной полосой. Одним из надежных флуориметров является детектор «Кратос».

В качестве причин уменьшения чувствительности детекторов следует указать на поглощение излучения при высокой концентрации вещества в ячейке, а также на потерю излучения за счет отражения от окошек ячейки. Поэтому при работе с флуориметром следует использовать достаточно разбавленные растворы, кроме того, возможно применение детекторов без окошек, например с Не—Cd-лазером.

Некоторые нефлуоресцирующие соединения разделяют в виде производных с флуорогенными веществами. Производные получают до хроматографического разделения или после, вводя реагент в Т-образное устройство между колонкой и детектором. Амины и фенолы образуют диазильные производные при взаимодействии с 5-диметил-амино-1-нафтилсульфохлоридом до разделения, а аминокислоты после разделения обрабатывают флуорескамином.

Флуориметр применяют при анализе микропримесей, когда мала концентрация растворенного вещества, подлежащего обнаружению. Хотя динамический диапазон флуориметра достаточно большой (104), его линейный динамический диапазон может быть ограничен для некоторых растворенных веществ относительно узким интервалом концентраций (10-кратным). Для количественного анализа его следует проверять в интересующем интервале концентраций.

Перед количественным измерением необходимо убедиться в отсутствие фоновой флуоресценции, эффектов гашения и проверить отклик детектора на реальный образец.

Кислородосодержащие растворители гасят флуоресценцию, и их так же как и элюенты, поглощающие свет в области возбужденного излучения, нельзя применять. Галогенсодержащие растворители (хлороформ и метиленхлорид) должны быть использованы с осторожностью, так как имеют тенденцию ослаблять флуоресценцию. Если в растворителе нет флуоресцирующих веществ, флуориметр может работать в градиентном режиме. Флуориметр меньше, чем другие детекторы, зависит от изменений температуры или давления. Однако уменьшение температуры или увеличение вязкости некоторых растворителей затрудняет флуоресценцию.

1.4.5 Другие детекторы

Кроме детекторов, описанных выше, для ВЭЖХ используют и другие приборы: электрохимический, инфракрасный, детектор с диодной матрицей, масс-спектрометрический, транспортный с пламенно-ионизационным детектированием, радиоактивный, по диэлектрической проницаемости, электронозахватный, кулонометрический и др. Одни из них обладают высокой селективностью или чувствительностью, другие дают важную качественную информацию. Рассмотрим более подробно некоторые из них.

Рис. 1.14. Электродная ячейка электрохимического детектора: 1 — выход колонки; 2 — к электроду сравнения; 3 — фтороплатовая прокладка; 4 — рабочая камера кюветы; 5 — рабочий электрод; 6 — блок ячейки

Электрохимический детектор. Этот детектор можно применять для анализа всех веществ, обладающих электрохимической активностью, т. е. способ при определенном потенциале окисляться или восстанавливаться, соответственно отдавая или принимая гектроны. В водных растворах эти потенциалы могут быть от +1,2 до -0,8 В (электрод сравнения — хлорсеребряный).

Вещества, содержащие фенольную, индольную или альдегидную группы, способны окисляться при низких потенциалах (0,4—0,7 В), а вещества с нитро- или кетогруппами — восстанавливаться. Так, важные в биологии классы веществ — катехоламины и 5-гидроксииндолы — в этих условиях способны окисляться, отдавая два электрона. При этом и возникает ток в кювете детектора, который затем усиливается амперометрическим детектором.

Электродная ячейка (кювета), схема которой представлена на рисунке 1.14, состоит из двух блоков, разделенных фторопластовой прокладкой с вырезом, представляющим собой рабочую камеру. В центре камеры расположен тонкослойный электрод (анод) из стеклоуглерода. Электрод сравнения размещается на выходе из ячейки. Вместимость рабочей камеры 1 мкл, что позволяет работать с микроколонками.

Электрохимический детектор более селективен при низких потенциалах рабочих электродов. Для 5-гидроксииндолов нужен потенциал 0,5—0,55 В, для катехоламинов — 0.5—0,7В, для пептидов — 0,9—1,2В. Чувствительность и специфичность электрохимического детектора высокие. По чувствительности они не уступают кулонометри-ческим детекторам, хотя окисляющая способность тонкослойных электродов с рабочей поверхностью 2—4 мм2 составляет лишь 1—10% от количества анализируемого вещества. Нижний предел детектирования катехоламинов и 5-гидроксииндолов составляет от 5 до 20 пг введенного в колонку вещества. На рис. 8.15 приведена хроматограмма 5-гидроксииндолов из солянокислого экстракта 0,5 мл плазмы крови.

При работе с электрохимическим детектором необходимо учитывать следующее. Фоновые шумы тем ниже, чем чище используемые реактивы, поэтому фосфаты нужно очищать перекристаллизацией, использовать высокочистую воду и растворители марок «осч» или для ВЭЖХ. Шлифовать поверхности рабочего электрода следует по мере его загрязнения и увеличения шумов не чаще 1 раза в месяц с последующей промывкой его 50%-ным метанолом. Обязательным является хорошее дегазирование растворителей, желательно продувкой гелием.

Электрохимический детектор находит применение в анализе катехоламинов, серотонина, ацетилхолина и их метаболитов, нейропептидов, ряда лекарственных препаратов. Его можно использовать для анализа фенолов, ароматических аминов, тиоспиртов, аскорбиновой кислоты, мочевой кислоты и других веществ в режиме окисления. В режиме восстановления им можно детектировать хиноны, нитросоединения, металлоорганические и другие coединения.

Существуют другие типы ячеек, кроме вышеописанной, в том числе с капающим ртутным электродом, трубчатым электродом, многоэлектродные ячейки и др. УФ-детектор с диодной матрицей. Как уже отмечалось выше, в УФ-детекторах широко распространенных типов используют прохождение через кюветы (как образца, так и сравнительной) монохроматического света. В УФ-детекторе с фильтрами такой свет из линейчатого спектра испускания ртутной лампы вырезается фильтром, а в спектрофотометре — вырезается из широкого спектра испускания дейтериевой лампы с использованием дифракционной решетки. Только в сканирующем спектрофотометре (например, с «прыгающим» зеркалом, используемым в «Милихроме») кювета освещается последовательно несколькими монохроматическими лучами света. В последнее время появилось очень изящное решение, позволяющее получать непрерывно информацию о полном УФ-спектре веществ, проходящих через кювету. В этом случае через кювету проходит полихроматический свет, т.е. весь непрерывный спектр испускания дейтериевой лампы, который после кюветы попадает на дифракционную решетку, где делится на монохроматические пучки, каждый из которых попадает далее на свою фотоячейку (фотодиод), расположенные в ряд или линейку. Отсюда название — детектор с диодной матрицей или диодной линейкой. С каждой такой ячейки можно в любой момент получить информацию о том, как вещество, проходящее через кювету, поглощает свет при данной длине волны. Существуют диодные линейки с разным числом диодов: 8, 32, 64 и более.