Б) Индикация вируса в исследуемом материале. Из каждого отдела головного мозга левой и правой сторон (аммонова рога, мозжечка, коры полушарий и продолговатого мозга) готовят по 4 препарата - мазки-отпечатки для РИФ и обнаружения телец Бабеша-Негри; с мозговой тканью ставят РДП. При отрицательных результатах вышеуказанных методов ставят биопробу на мышах.

В) Обнаружение специфических телец-включений. Приготовленные мазки-отпечатки окрашивают по Серерсу, Муромцеву или другими методами. Препараты после окрашивания просматривают в световом микроскопе с иммерсионной системой. Положительным результатом считают наличие специфических телец Бабеша-Негри. Это четко очерченные овальные или продолговатые гранулярные образования розово-красного цвета в протоплазме (при окраске по Селерсу); при окраске по Муромцеву - тельца Бабеша-Негри светло-фиолетовые с темно-синими включениями, чаще они располагаются вне нервных клеток. Тельца Бабеша-Негри выявляют лишь в 65 - 85 % случаев бешенства. Поэтому отсутствие их не является отрицательным ответом и материал исследуют в других тестах (РИФ, РДП, биопроба) .

Посмертно исследуют срезы аммоновых рогов головного мозга и обнаруживают в них специфические включения - тельца Бабеша-Негри. Тельца Бабеша-Негри также присутствуют в цитоплазме нейронов, гиппокампе, клетках Пуркинье коры мозжечка, стволе мозга, гипоталамусе и спинномозговых ганглиях. Данные тельца присутствуют в головном мозге только при бешенстве, наличие их при других заболеваниях, в том числе и при заболеваниях центральной нервной системы, не зафиксировано.

Состоят тельца Бабеша-Негри из тонковолокнистого матрикса и вирусного рибонуклеопротеида, размер телец - около 10 нанометров.

Г) Обнаружение вирусного антигена с помощью серологических реакций.

Реакция иммунофлуоресценции является одним из основных тестов при диагностике бешенства. При высококвалифицированном выполнении получают 99 - 100%-ные совпадения с методом биопробы. Обычно в диагностической практике используют прямой метод РИФ, который проводят по общепринятой методике с применением антирабического флуоресцирующего иммуноглобулина. Антиген вируса бешенства выявляется в виде ярких желто-зеленых или зеленых гранул различных форм и величины в клетках (чаще вне клеток). Диагноз считают установленным, если в нескольких полях зрения обнаруживают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленым свечением или множество мельчайших точек - "песка". В контроле подобного свечения не должно быть.

Метод ИФ дает возможность обнаруживать вирус бешенства в клетках роговицы глаза и прижизненно поставить диагноз. Метод может быть использован для исследования животных, подозреваемых в заболевании бешенством, а также клинически здоровых собак и кошек, покусавших людей и животных. Для этого готовят отпечатки с роговицы (соблюдая все правила личной профилактики). Раскрывая глазную щель животного большим и указательным пальцами, на слегка выпяченное глазное яблоко надавливают поверхностью предметного стекла, отступив на 0,5 см от конца. Следует следить, чтобы животное не моргало третьим веком, так как при этом со стекла удаляются эпителиальные клетки и получается некачественный мазок.

Результаты микроскопии считают положительными если в отпечатках роговицы животного обнаруживают 11% и более клеток с характерными очажками свечения. Необходимо иметь в виду, что в препаратах от здоровых животных (контроль) вследствие аутофлуоресценции могут встречаться единичные клетки с подобными по форме и свечению очажками. Метод ИФ дает возможность ускорить ответ при окончательной постановке диагноза методом биопробы. Диагноз может быть установлен уже на 4 -8-й день после заражения мышей исследуемым материалом, а инкубаторный период заболевания мышей достигает 20 дней. РИФ может выявить вирус бешенства в тканях подчелюстной слюнной железы.

Реакцию диффузионной преципитации применяют для обнаружения антигена вируса бешенства в неконсервированном головном мозге животных, павших от уличного бешенства, или мышат, используемых в биопробе. РДП ставят микрометодом на предметных стеклах. Реакцию учитывают через 6, 24, 48 ч. При наличии одной или двух-трех линий преципитации между лунками, содержащими антиген и иммуноглобулин, реакцию считают положительной. РДП проста по выполнению и специфична, но процент выявления вирусного антигена в исследуемом материале от 45 до 70. Отсутствие в исследуемом материале телец Бабеша-Негри, специфической флуоресценции и отрицательная РДП не дают основания исключить наличие вируса. В этом случае окончательный диагноз ставят по результатам биопробы на белых мышатах и последующей идентификации вируса.

Д) Обнаружение вируса методом биопробы. Принято считать, что биопроба является более эффективным методом, чем обнаружение телец Бабеша-Негри, РИФ и др. Однако в единичных случаях оказалось отрицательной, несмотря на подтверждение диагноза бешенства путем обнаружения телец Бабеша-Негри и РИФ. Процент отрицательных результатов по биопробе колебался в пределах 1,3 - 12.

Из всех видов использованных для биопробы животных (кролики, морские свинки, взрослые белые мыши и хомяки) многие отдают предпочтение мышам-сосунам, поскольку они более чувствительны к разным штаммам вируса бешенства и менее опасны в работе. В диагностической практике рекомендуется следующая методика постановки биопробы. Для каждой исследуемой пробы полевого материала используют 6 - 10 молодых мышат массой 16 -20 г или сосунков в возрасте 20 -25 суток массой 6 - 8 г., которых заражают 10%-ной суспензией, приготовленной из всех отделов головного мозга по общепринятой методике: 50 % мышат заражают интрацерибрально дозой 0,015 - 0,03мл (в зависимости от массы мышей ) и 50 % - подкожно в верхнюю губу дозой 0,1 - 0,2 мл. за зараженными мышами наблюдают ежедневно в течение 30 дней. Гибель их до 48 часов не учитывают. При наличии вируса в исследуемом материала у мышей на 6 -10 -15 -20-й дни развивается клиника: взъерошенность шерсти, своеобразная горбатость спины, нарушение координации движения, паралич задних, затем передних кончностей и гибель. у павших мышей исследуют головной мозг на наличие телец Бабеша-Негри в Риф и РДП. Биопробу считают положительной, если в препаратах из мозга зараженных мышей обнаруживают тельца Бабеша-Негри или выявляют антиген в РИФ или в РДП.

Е) выделение вируса из исследуемого материала. Естественно-восприимчивых животных (собаки, кошки, крупный и мелкий рогатый скот), а также куриные эмбрионы и культуру клеток для выделения вируса не применяют. Используют лабораторных животных.

Ж) Идентификация выделенного вируса с помощью серологических реакций.

Иммуноферментная идентификация вируса. Разработан и успешно применяется в ряде стран иммуноэнзиматический метод обнаружения вируса бешенства (реакция ELISA). Метод точный, быстрый, дающий высоковоспроизводимые результаты и доступен для выполнения.

Реакцию нейтрализации на мышатах используют редко.

Реакция торможения гемагглютинации еще не нашла широкого применения в диагностической практике из-за присутствия в сыворотке крови неспецифических ингибиторов, к которым вирус бешенства высокочувствителен, а главное, неочищенные гемагглютинирующие агенты обладают низкой чувствительностью. Используют гусиные эритроциты.