Устойчивость

В литературе накопилось много данных об устойчивости витамина B12 к действию как реактивов, так и лекарственных препаратов; многие из этих данных можно теперь истолковать, исходя из строения и реактивности различных частей молекулы витамина. Кристаллический цианкобаламин в твердом состоянии устойчив даже при действии температуры 100° в течение нескольких часов. По Березовскому, при нагревании кристаллического цианкобаламина при 100° происходит медленное разложение. В водных растворах он наиболее устойчив при рН от 4 до 6 (по Березовскому до 7); в этих пределах рН растворы можно стерилизовать автоклавированием при 120° с потерей лишь нескольких процентов активности. При pH 9 происходит быстрое разложение (примерно 90% в сутки).

Аквокобаламин менее устойчив, особенно в щелочном растворе, но оба вещества инактивируются примерно на 90% в течение 1 часа при 100° при рН 8. Нагревание в сильно щелочном растворе использовали для количественного разрушения витамина B12 с целью контроля при некоторых методах микробиологического определения активности. Однако в неочищенных препаратах некоторые восстанавливающие вещества могут оказывать защитное действие. Нейтральные или слегка кислые растворы витамина B12 при комнатной температуре в темноте сохраняются годами, только в очень сильно разведенных растворах идет медленный гидролиз с образованием небольших количеств фактора В. В сильно кислых и, особенно в щелочных растворах при комнатной температуре происходит медленный гидролиз до карбоновых кислот. На свету цианид медленно отщепляется и образуется оксикобаламин, но при выдерживании раствора в темноте происходит обратный процесс. Длительное воздействие солнечного света ведет к необратимому разрушению. Характер действия восстановителей не всегда можно предсказать с уверенностью. Утверждают, что тиоловые соединения в низких концентрациях защищают витамин от разрушения, и их даже используют иногда с этой целью при микробиологических определениях, однако в больших количествах они сами могут вызвать разрушение витамина. Сульфит также рекомендовали применять для защиты Кобаламинов, особенно оксикобаламина. Аскорбиновая кислота действует не так, как другие, восстановители. Она довольно быстро разрушает витамин B12b, но почти не действует на витамин B12. Данное наблюдение использовали при анализе смесей этих двух веществ, но такой метод пригоден лишь для сравнительно чистых растворов. В печеночных экстрактах содержится защитный фактор, которым оказалось железо; другие металлы, например медь, катализируют реакцию. В сухих лекарственных препаратах витамин B12 устойчив при растирании в порошок с хлористым натрием или с маннитом. Растворы можно стабилизировать фенолом, подвергнутым двойной перегонке, хотя примеси, содержащиеся иногда в феноле, могут вызывать разрушение витамина. Совместное присутствие тиамина (витамина B1) и никотинамида (или никотиновой кислоты) ведет к медленному разрушению витамина B12 в растворе. Железо защищает витамин В12 от взаимодействия с никотиновой кислотой.

Механизм действия

Недостаток в пище витамина B12 приводит к макроцитарной мегалобластической анемии. Нарушается работа нервной системы, наблюдается резкое снижение кислотности желудочного сока. Впрочем, авитаминоз В12 может развиться даже при полноценном питании, т. к. для процесса всасывания витамина в тонкой кишке обязательно наличие в желудочном соке особого белка – гастромукопротеина (фактор Касла). В полном соответствии с буквальным переводом своего латинского названия, этот белок выделяется стенками желудка, теми же клетками, которые выделяют кислоту. Фактор Касла специфически связывает витамин В12. Точная роль этого фактора не выяснена. Полагают, что в составе комплекса с гастромукопротеином витамин всасывается в тонком кишечнике и поступает в кровь портальной системы в комплексе с транскобаламинами I и II, при этом фактор Касла гидролизуется.

Когда биохимики привыкли к мысли, что витамин В12 не просто специфический антипернициозный фактор, а один из витаминов группы В, они стали предполагать, что он подобно другим водорастворимым витаминам окажется кофактором по крайней мере в одной ферментной системе. Но вопреки ожиданию функции, приписываемые витамину B12 различными исследователями, оказались столь многочисленными и разнообразными, что трудно было представить себе, как все они могли быть связаны с такой ролью кофактора. Поэтому стали искать его основную функцию. Например, казалось вероятным, что он каким-то образом ответствен за поддержание сульфгидрильных соединений в восстановленном реактивном состоянии; он мог бы, скажем, "активировать" различные SH-ферменты, препятствуя их окислению в неактивные S-S-формы. Или если он связан с синтезом белка, он был бы необходим для синтеза белковой части (апофермента) ряда ферментов.

Позднейшие исследования, особенно с применением изотопов, поставили под сомнение некоторые из приписываемых витамину В12 функций и выдвинули на первый план другие. Однако ряд новейших результатов еще не подтвержден.

Отношение к сульфгидрильным ферментам

Влияние концентрата витамина B12 на восстановление некоторых S-S-соединений в SH-форму изучал в o1950 г. Дубнов на ферментных системах in vitro. Он высказал предположение, что восстановлением гомоцистина в гомоцистеин, легко присоединяющий метильную группу, можно, было бы объяснить действие витамина B12 на синтез метионина. Поддержание глутатиона в восстановленномм состоянии могло бы играть роль в активации SH-ферментов. Эти гипотезы были подкреплены последующими наблюдениями. При рецидивах пернициозной анемии, а также у крыс, получающих рацион с недостатком витамина В12 концентрация сульфгидрильных соединений (главным образ6м глутатиона) в крови ниже нормальной, и в обоих случаях она поднимается до нормы или после введения витамина. Быстрота этой реакции позволяет думать, что это непосредственный результат действия витамина. Однако Жаффе вовсе не обнаружил подобного действия у мышей.

Согласно Лингу и Чоу и другим авторам, при авитаминозе В12 нарушено использование углеводов. Это могло бы быть связано с низкой концентрацией глутатиона двояким образом. Сульфгидрильные группы некоторых гликолитических ферментов могли бы окисляться до неактивной S-S-формы: в частности, глутатион является простетической группой одного ключевого фермента – глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Позднее Дубнов подверг дальнейшей проверке свою гипотезу реактивации SH-ферментов, использовав покоящиеся клетки мутанта Е. coli, нуждающегося в витамине B12. Он нашел, что активность ряда таких ферментов вначале была так же высока, как и в клетках "дикого" штамма, но снижалась по мере старения культур и могла быть вновь повышена добавлением витамина B12 или глутатиона, причем гораздо эффективнее было добавление их обоих.

Обмен жиров и каротина

Благотворное действие витамина В12 на обмен жиров у животных аналогичным образом приписывали поддержанию кофермента А в активном восстановленном состоянии. У крысят, получающих рацион с недостатком витамина B12, организм не способен синтезировать жиры, а у взрослых крыс нарушается использование жиров пищи так что животные становятся тучными в результате избыточного накопления жира. Полагают, что этот эффект лишь частично объясняется, действием витамина B12 на синтез метионина, в результате которого, в свою очередь, увеличивается количество липотропных веществ – холина и бетаина. Установлено, что витамин B12 повышает всасывание каротина или превращение его в витамин А у крыс (на что указывает повышенное накопление последнего в печени); хотя и не влияет на накопление готового витамина А. Механизм этого действия еще неясен.