НИЗИНЫ (NISINS).

Низины относятся к антибиотикам, которые образуются собственно бактериями. Антибиотическое вещество - низин - выделен из культуры молочнокислого стрептококка Streptococcus lactis. Низин подавляет развитие ряда грамположительных и некоторых кислотоустойчивых бактерий, не оказывает влияния на грамотрицательные бактерии, дрожжи и плесневые грибы. Этот антибиотик подавляет развитие многих микроорганизмов: пневмококки, группу стрептококков, различные виды Bacillus , Clostridium, Mycobacterium tuberculosis, Lactobacillus, Corynebacterium, немногие виды Streptomyces, Micrococcus pyogenes. Низин не оказывает антимикробного действия на Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella, некоторые виды Neisseria. Свойства низина, а также особенности его химического строения привлекли к этому антибиотику внимание ученых. Что касается применения, следует отметить, что низин не используется в медицинской практике, но с успехом применяется в ветеринарии для лечения маститов у коров. Также имеет большое применение в пищевой промышленности в качестве консерванта некоторых скоропортящихся продуктов, а также для предупреждения порчи сыров. Есть сообщения об активности низина в отношении малярийного плазмодия, но этот вопрос пока остается не до конца изученным.

Строение низина.

Установлено, что низин имеет молекулярную массу, равную 3500, он может полимеризоваться и образовывать димер (молекулярная масса 7000) и тетрамер. Полимеризацию низина связывают с наличием в его молекуле дегидроаланина. В состав молекулы низина входят 30 аминокислотных остатков следующих аминокислот: лизин, гистидин, аспарагиновая кислота, серин, пролин, глицин, аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, остатки редко встречающихся серосодержащих аминокислот: лантионин и b-метиллантионин, ненасыщенные аминокислоты - дегидроаланин и b-метилдегидроаланин.

В 1970 году установлена следующая структура молекулы низина:

H2N - Иле - Мга - Ала - Иле - Дга - Лей - Ала - Амк - Про - Глу - Ала -

S S

- Лиз - Амк - Гли - Ала - Лей - Мет - Гли - Ала - Асп - Мет - Лиз -

S

S

- Амк-Ала- Амк - Ала - Гис - Ала - Сер - Иле - Гис - Вал - Дга - Лиз - СООН

Дга - дегидроаланин; Амк - аминомасляная кислота; Мга - b-метилдегид-роаланин. Определено положение двух сульфидных мостиков, образованных остатками b-метиллантионина. Этот фрагмент имеет бициклическую структуру:

Биологическая активность низина обусловлена наличием в его молекуле a,b-ненасыщенных аминокислот (дегидроаланин, b-метилдегидроаланин). Димеры и тетрамеры низина, подобно мономеру, обладают биологической активностью. Низин влияет на споры чувствительных к нему бактерий, которые более богаты катионами по сравнению с вегетативными клетками, и выступает как катионитный детергент. Низин, адсорбируясь на поверхности спор, в момент прорастания спор нарушает прониаемость цитоплазматичесой мембраны и таким образом подавляет рост развивающихся клеток бактерий. Этот антибиотик способен реагировать с сульфгидрильными группами биологически важных соединений, выводя их из реакций метаболизма.

Технологические стадии производства низина.

1. Приготовление посевного материала.

Штаммы-продуценты

из пробирок

¯

в колбы со стерильной питательной средой на качалки, оптимальные tо и рН=6.5 - 6.8.

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½ ½

½

½

½

½

½

½

½

½

¯

Инокуляторы для наращивания посевного материала (малый посевной аппарат, затем большой посевной аппарат; постоянный долив питательной среды)

¯

С понижением рН среды увеличивается выделение низина из клеток в культуральную жидкость. При рН=4.3 более 90% низина выделяется в среду, а при рН=6.8 выделяется 40% антибиотика.

ü Но интенсивная аэрация культуры молочнокислого стрептококка не оказывает благоприятного влияния ни на рост бактерий, ни на образование низина.

Питательная среда: в средах, содержащих недостаточное для нормального развития количество азота (1-2 мг% NH2 при норме 29 мг%), сильно снижается рост стрептококка и образование антибиотика. Лучшими азотсодержащими компонентами в средах являются дрожжевой автолизат, пептон, казеиновый гидролизат. Высокий выход антибиотика наблюдается при развитии молочнокислого стрептококка на средах, содержащих аммонийные соли органических кислот.

Источник углерода - глюкоза. Добавление к среде с глюкозой двух-, трех-, четырех- и пятиуглеродных органических кислот способствует повышению роста продуцента антибиотика и некоторому увеличению образования им низина.

При засеве свежей питательной среды культурой Streptococcus lactis вместе с посевным материалом вносится и низин, так как количество общего низина в процессе развития бактерий снижается и к концу периода лаг-фазы клетки стрептококка практически не содержат антибиотика. А синтез низина происходит после экспоненциального роста бактерий в период ранней стационарной фазы.

2. Установка для биосинтеза антибиотика

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½ ½

½

½

½ ½

½

½

½

½

½

½ ½

¯

Снижение общего количества низина в лаг-период развития Streptococcus lactis и синтез антибиотика в более поздний период роста подтверждает значение низина в качестве важной части бактериального ростового цикла стрептококка (низин, по-видимому, связан с контролирующим механизмом, который не оказывает влияния на скорость роста продуцента антибиотика, но задерживает начало роста новых клеток). Снижение синтеза антибиотика к концу периода лаг-фазы обусловлено изменением третичной структуры или степени полимеризации антибиотика. Этого процесса инактивации низина можно избежать путем добавления в среду казеина, в результате чего наблюдается стабилизация антибиотической активности и большое образование низина. У низина в отличие от других полипептидных антибиотиков путь синтеза сходен с путем образования белков, т.е. связан с рибосомным механизмом. Синтез низина идет через образование низиноподобных белков-предшественников биосинтеза антибиотика, причем превращение пренизина в низин происходит под действием фермента на внешней поверхности клетки стрептококка (есть предположение и о том, что ответственность за биосинтез низина несут определенные плазмиды, в которых локализованы соответствующие гены образование молекулы антибиотика). Сам механизм биосинтеза низина и его молекулярная масса позволяют рассматривать этот антибиотик не как полипептид, а как низкомолекулярный основной белок.

3. Стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток микроорганизма и фильтрации (отделения культуральной жидкости от биомассы продуцента).