Цифровой материал обрабатывали, используя общепринятые методы математической статистики ( Ашмарин И.П., Воробьёв А.А., 1962; Терентьев П.В., Ростова Н.С.,1977 ).

2. Результаты исследований.

2.1. Свойства возбудителей, таксономическое положение и разработка лабораторной диагностики актинобациллёзной (гемофилёзной) плевропневмонии и гемофилёзного полисерозита свиней . 2.1.1. Питательные среды и культивирование A.pleuropneumoniae и H.parasuis.

Конструирование питательных сред для культивирования A.pleuropneumoniae и H.parasuis предполагает учёт потребности данных видов в НАД. Минимальный уровень зоны оптимума у обоих видов бактерий близок и составляет 1,8 - 3,6 НАД в 1 среды. Верхний пороговый уровень имеет видовые и штаммовые различия, причём он ниже у H.parasuis (15,62 – 31,25 мкг/), чем у A.pleuropneumoniae (250мкг/) и, в свою очередь, он меньше в пределах вида H.parasuis у свежевыделенных эпизоотических штаммов, нежели у адаптированных музейных культур. Полученные данные позволили обоснованно конструировать питательные среды свиноводства учётом возможных штаммовых потребностей в НАД. Из естественных источников НАД наиболее доступен и эффективен дрожжевой экстракт. Переживающие животные ткани также содержат достаточное для роста V - зависимых бактерий количество НАД. Наиболее удобно в этом случае использовать кровяной сгусток на агаре Цинссера или сывороточном агаре.

Испытание различных видов питающих культур бактерий как продуцентов НАД показало, сто ростовой фактор экскретируют в достаточных количествах интенсивно растущие виды бактерий (эшерихии, сапрофитные бациллы, стафилококки), которые обеспечивают зону от 16,8 ± 0,89 мм до 31,6 ± 1,14мм в зависимости от вида бактерий и типа питательной среды.

Однако, при использовании культур стафилококков, установили, что некоторые из них ингибируют сателлитный рост A.pleuropneumoniae. Мы не обнаружили описание подобного феномена, хотя он известен у P.multjcida. Но в литературе есть сообщения о наличии гиалуроновой кислоты в составе капсулы некоторых штаммов A.pleuropneumoniae. Следовательно, причиной ингибиции роста может быть синтез культурой стафилококка гиалуронидазы. Мы также не исключаем вероятность образования продуцентом НАД соединений типа НАД-азы. В любом случае, питающая культура бактерий должна быть предварительно проверена по указанному критерию.

Определение НАД - зависимости – важный этап в идентификации A.pleuropneumoniae (1-й биовар) и H.parasuis. Наши данные о том, что референтные и эпизоотические культуры A.pleuropneumoniae периодически могут утрачивать НАД- зависимость, причём это касается любого штамма 1-го биовара. Явление НАД -зависимости может быть восстановлено у культур, утративших это свойство, путём культивирования на «обеднённой» питательной среде с локальным источником НАД. Следовательно на обычных питательных средах животного происхождения культуры, потерявшие НАД зависимость, утилизируют какие-то предшественники НАД, отсутствующие, например, в глюкозо-казеиновом агаре. На последней питательной среде их рост возможен только в присутствии НАД, зависимость от которого они приобретают вновь.

Результаты исследований по изучению НАД - зависимости гемофильных бактерий позволили нам дать оценку и рекомендовать для практических целей сочетание питательных сред, позволяющих в условиях диагностической лаборатории тестировать V - и Х - зависимость.

Исследования показали отсутствие СО2 - зависимости у изученных культур H.parasuis и A.pleuropneumoniae, а также не удалось обнаружить существенных различий в частоте изоляции культур из патологического материала в условиях обычной атмосферы и повышенного содержания СО2 . Оба вида бактерий показали сильную зависимость от наличия в питательной среде сыворотки крови. У H.parasuis эта потребность выражена сильнее, чем у A.pleuropneumoniae. При отсутствии в питательном субстрате сыворотки крови оба вида бактерий быстро диссоциируют.

Количественные показатели, характеризующие рост A.pleuropneumoniae и H.parasuis в жидкой питательной среде (бульон Хоттингера, 120мг % аминного азота, рН 7,6,5,% сыворотки крови крупного рогатого скота, 10% дрожжевого экстракта), свидетельствуют о более интенсивном росте первого вида, в частности, период генерации соответственно составил 40,8 и 67 минут, удельная скорость роста 1,008 и 0,622, прирост бактериальных клеток за 1 час культивирования 0,44 и 0,27 log.

Оценка питательных сред для первичной изоляции культур H.parasuis и A.pleuropneumoniae (1-й биовар) показала, что для этой цели могут быть использованы агар и бульон Левинталя, «шоколадный» агар, сывороточно-дрожжевой бульон и агар, сывороточный и кровяной агар, с локальными источниками V - ростового фактора. Предпочтительнее использование прозрачных питательных сред, позволяющих получать более полную информацию об особенностях колонии. Использование сред с локальными источниками НАД даёт важную информацию на первом этапе бактериологического исследования о НАД -зависимости, а в случае кровяного агара - также о гемолитической активности бактерий. Применение питающих бактерий как источника НАД требует отвивки культур в течении 24-48 часов из-за быстрой их гибели под влиянием метаболитов «баккормилок». Подращивание материала в течении 6-8 часов в сывороточно - дрожжевом бульоне, содержащем бацитрацин, с последующим рассевом на среды увеличивает вероятность выделения культур НАД--зависимых бактерий.

Для поддержания культур H.parasuis и A.pleuropneumoniae при текущей работе в наибольшей степени подходят оптимальные плотные питательные среды с заливкой культур вазелиновым маслом при температуре хранения 5-8°С. Наиболее длительно сохраняют жизнеспособность (6-7 недель) культуры, выращенные в сгустках крови и сохраняемые в замороженном состоянии.

2.1.2. Методы и результаты идентификации НАД--зависимых бактерий, выделенных от свиней, по культурально - морфологическим, ферментативным и генетическим свойствам.

Исследование ферментативных свойств НАД – и гемин – зависимых культур бактерий проводили на рутинных дифференциально-диагностических средах с добавлением ростовых факторов, а также на жидких средах Гисса в микрообъёмах и диагностических системах ПБДЭ и СИБ Горьковского НИЭМ. Максимальное совпадение результатов было получено на общепринятых средах, в ПБДЭ и микрообъёмах.

Таксономическое положение 165 культур НАД--зависимых бактерий, выделенных от клинически здоровых свиней, а также животных с явлениями фибриозно-геморрагической плевропневмонии или генерализованных серозитов, было исследовано при помощи нумерического анализа. В качестве опорных в данную коллекцию культур были включены типовые штаммы Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, H.parasuis, H.parainfluenzae, H.influenzae, A.ligieresii, A.suis. У каждого исследованного штамма были определены 57 фенотипических признаков, характеризующих их культуральные и ферментативные свойства. Все полученные данные были преобразованы в числовую форму, подвергнуты нумерическому анализу свиноводства конечным представлением полученных результатов в виде дендрограммы.