1. Введение

1.1. История вопроса

1.2. Перспективы исследований

2. Биологическая роль митохондрий

3. Ультраструктура митохондрий

3.1. Общие принципы организации

3.2. Особенности строения мембраны митохондрий

4. Описание общих принципов различных методов выделения митохондрий

4.1. Гомогенизация материала

4.1.1. Механическая

4.1.2. На основе кавитации газов

4.1.3. Ультразвук

4.2. Разделение субклеточных компонентов

4.2.1. Центрифугирование

4.2.2. Разделение в двухфазной системе, содержащей два полимера

4.2.3. Электрофорез

4.2.4. Ферменты - маркеры митохондрий

5. Методики

6. Заключение

7. Список литературы

Введение

История вопроса.

Кёлликер одним из первых описал характерным образом ориентированные гранулы в саркоплазме поперечно-полосатой мышцы. Ему принадлежит так же честь первого выделения митохондрий из клеточных структур. В 1888 году он выделил эти гранулы из мышцы насекомых и показал, что они обладают мембраной и набухают в воде. Началом новой эры в цитологическом изучении митохондрий явилась работа Бенсли и Хэрра, которые предприняли попытку выделить митохондрий из взвеси разрушенных клеток печени, применив метод дифференциального центрифугирования. Из-за отсутствия подходящей среды для суспендирования и несовершенства метода центрифугирования Бенсли не удалось получить интактные митохондрий, но именно новаторская работа Бенсли определила слияние цитологических исследований митохондрий с исследованиями дыхания.

Перспективы исследований.

В настоящее время основная задача изучения митохондрий на молекулярном уровне сводится к выделению ферментативных компонентов окислительных циклов, определения их молекулярной структуры и механизма действия, анализу их участия в полиферментных системах в митохондриях и картированию их локализации на структурах митохондрий. То обстоятельство, что ферменты дыхательной цепи составляют более 25 % белка митохондриальных мембран заставляют рассматривать эти ферменты не только как функциональные, но и как структурные элементы митохондрии.

Биологическая роль митохондрий.

На протяжении ста с лишним лет, т. е. со времени первых работ Кёлликера (1850), наблюдавшего гра­нулы в саркоплазме поперечнополосатых мышц, велись кропотливые морфологические исследования, которые постепенно подготавливали почву для всестороннего изучения природы митохондрий. Но только в 1949 г. Кеннеди и Ленинджер установили, что в митохондриях протекает цикл окислительного фосфорилирования, т.е. что митохондрий служат местом генерирования энергии. С этого момента начинается новая эра в изучении мито­хондрий — эра, в которой блистательные открытия сле­дуют одно за другим. В короткий срок были открыты осмотическая, сократительная, регуляторная и генети­ческая функции митохондрий и найдены многие из тех молекулярных структур, которые служат первичным субстратом 'этих функций. Было показано также, что митохондрий обеспечивают интеграцию многочисленных процессов клеточного обмена. Эти исследования еще не, завершены, но они могут служить примером плодотвор­ности нового подхода к изучению живого, того подхода, который отличает молекулярную биологию.

В развитии молекулярной биологии за последнее время наметился новый этап. До сих пор это были ис­следования главным образом, на уровне однородных молекул белков и нуклеиновых кислот, исследования, по­священные их структуре, функции и биосинтезу. Теперь же исследователь не довольствуется этим и переходит к изучению специфически организованных надмолекулярных комплексов, каковыми являются клеточные органеллы. Некоторые функции этих органелл также мо­гут быть истолкованы на уровне индивидуальных моле­кул, например молекул отдельных ферментов. Но глав­ная особенность клеточных органелл — это интеграция ферментативных процессов. Так, благодаря наличию в составе митохондрий различных белков, липидов, ну­клеиновых кислот и углеводов, соединению их между собой и упорядоченному размещению в пространстве в виде трехслойных мембран эти образования приобре­тают свойства, которые исчезают при их расчленении на отдельные молекулы. Свойства эти: векторный характер действия митохондриальных ферментов (в отличие от скалярного, т. е. не зависящего от направления, дей­ствия растворимых ферментов), способность к непосред­ственному преобразованию энергии окисления в осмоти­ческую и механическую энергию, способность к авто­номному синтезу белков и т. д. Каждое из этих свойств определяется не простой суммой реакций, катализируе­мых отдельными ферментами, а обусловлено взаимо­действием точно ориентированных ферментных и нефер­ментных макромолекул. Само собой разумеется, что глубокое исследование и познание природы клеточных органелл возможно лишь путем расчленения их на от­дельные молекулы с последующей реконструкцией.

Ультраструктура митохондрии

Общие принципы организации.

Внутренне пространство митохондрии окружено двумя непрерывными системами мембран, каждая из которых представляет собой замкнутый мешок; эти мешки расположены так, что всю митохондрию можно представить себе, как мешок внутри мешка. Просвет внутреннего мешка не сообщается с пространством между двумя мембранами. Наружная мембрана гладкая, а внутренняя образует многочисленные впячивания, которые в самом простом случае имеют форму перегородок, но могут принимать крайне сложные очертания. Палад назвал эти впячивания митохондриальными кристами. Другой характерный компонент структуры митохондрии - это матрикс, который заполняет просвет, окруженный внутренней мембраной. Известно, что он содержит много белка и некоторое количество липидов; по-видимому, он обладает определенной организацией и более или менее жесткой структурой. Наконец, митохондрии, фиксированные осмием часто содержат в матриксе ряд мелких гранул. Число, диаметр и плотность этих внутримитохондриальных гранул изменяются в зависимости от состояния обмена веществ в тканях.

Особенности строения мембраны митохондрии.

Так как наибольшее практическое значение представляют внутренние мембраны митохондрии, содержащие дыхательные ансамбли, имеет смысл более детально познакомиться с ультраструктурой митохондриальной мембраны. При детальном анализе было выявлено, что митохондриальные мембраны содержат 35 -40 % липидов, преимущественно фосфатидов, и 60 - 65 % белка. Небольшие различия, которые иногда наблюдаются обусловлены различными условиями получения при использовании различных физических и химических способов разрушения структуры митохондрии.

Митохондрии печени крысы содержат значительные количества фосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина, инозитфосфатидов, кардиолипина и фосфатидилсерина; содержание плазмалогена и сфингомиелина невелико, иногда они вовсе отсутствуют. Характерное содержание и количественное содержание липидов в митохондриальной мембране, вероятно обусловлены необходимостью поддержания термодинамически устойчивого двойного слоя липидов, образующего остов мембраны, который служит опорой для дыхательных ансамблей. По-видимому, большое значение имеет тот факт, что практически все липиды митохондриальной мембраны экстрагируются смесью хлороформ - метанол. Это указывает на наличие лишь незначительного числа ковалентных связей между липидами и белковыми элементами или даже на полное их отсутствие; этот факт свидетельствует о высокой степени стабилизации липидов и белков мембранных структурах. Крейн показал, что цитохром с соединяется с фосфатидилэтаноламином, образуя устойчивый комплекс. Возможно, что именно такое взаимодействие липид - белок совместно с гидрофобными связями и обеспечивает такую стабилизацию мембранной структуры. Криддл и сотрудники выделили мономерную форму, которую они назвали структурным белком митохондриальной мембраны. При нейтральном рН структурный белок находится в полимерной форме и не растворим в воде. Мономерная форма имеет молекулярный вес около 22000, но тенденция к полимеризации нарушает точность седиментационных и электрофоретических исследований. Структурный белок способен соединяться с чистыми цитохромами а, Ь, и ее образованием растворимых в воде комплексов в молярном отношении 1:1, причем условия этого взаимодействия для каждого случая различны. Предполагается, что в таких комплексах образуются преимущественно гидрофобные связи. Далее, оказалось, что структурный белок соединяется с фосфолипидами. Таким образом, структурный белок способен к взаимодействию с двумя другими основными молекулярными элементами мембраны - с переносчиками электронов и с фосфолипидами. Склонность цитохромов, флавопротеидов и структурного белка к существованию в мономерной и полимерной формах указывает на выраженную тенденцию этих молекул к образованию очень