Исследование механизмов транскрипции и процессинга первичных РНК-транскриптов проводят in vitro с использованием искусственным образом сконструированных транскрипционных систем (Manley et al., 1986; Dignam et al., 1983;Gutierrez-Hartmann et al., 1987; Хэймс,Хиггинс, 1987). Для этого могут быть выбраны два различных подхода. В первом случае изолируют ядра и в качестве транскрипционной матрицы используют неповрежденный хроматин. Синтез РНК проводят с добавлением всех необходимых реагентов и, в частности, три-фосфатов, в один из которых (обычно в урацил) вводят радиоактивную метку. При этом вновь синтезированные молекулы РНК оказываются мечеными. Выбор специфических молекул РНК проводят путем ДНК-РНК гибридизации, однако, в отличие от ранее описанных методов анализа мРНК, используют немеченые к ДНК-зонды, предварительно нанесенные на фильтры. Большим достоинством этой транскрипционной системы является ее максимальная приближенность к естественным процессам. При втором подходе транскрипция ведется с клонированных фрагментов ДНК, а ядерные экстракты служат источником ферментов и регуляторных белков.

Раздел 3. Анализ трансляции, ДНК-экспрессионные системы.

Традиционные методы анализа регуляции трансляции и посттрансляционных модификаций белков основаны на использовании модельных систем, представляющих собой цитоплазматические свободные от мРНК безядерные экстракты клеток, содер-жащие рибосомальный аппарат, транспортные РНК, набор аминокислот и ферментов, необходимых для трансляции и процессинга белков (Хэймс, Хиггинс, 1987; Клеменс, 1987 ). После добавления к такой системе специфической мРНК происходит синтез соответствующей полипептидной цепи in vitro. При введении меченых аминокислот в систему вновь синтезированные белки после электрофоретической очистки могут быть идентифицированы путем радиоавтографии либо иммунологическими методами,при наличии соответствующих антител (Клеменс, 1987). Однако,для значительного числа моногенных наследственных заболеваний первичный биохимический дефект неизвестен, а следовательно, не идентифицированы и мРНК транскрипты. Биохимическое изучение многих белков затруднено из-за их минорного содержания и отсутствия эффективных методов выделения и очистки. Последнее обстоятельство в значительной мере относится к нерасворимым белкам, ассоциированным с мембранными структурами клеток.ДНК-экспрессионные системы, то есть клеточные культуры, синтезирующие чужеродные белки, являются очень мощным средством анализа структуры, функции и синтеза белков (Sambrook et al., 1989). Такие системы конструируют на основе экспрессионных векторов, содержащих в своем составе сильные промоторы и регуляторные последовательности, обеспечивающие высокий, но в то же время регулируемый уровень экспрессии. Кодирующие последовательности чужеродных генов инсертируют (вставляют) с помощью соответствующих генно-инженерных приемов в область действия этих промоторов. Конечно, такие системы должны содержать и трансляционные сигналы,в частности, сайты связывания рибосом, обеспечивающие работу рибосомального аппарата клеток хозяина. В некоторых случаях экспрессионные векторы вводят в мутантные по протеазным генам клеточные культуры, с тем чтобы предотвратить деградацию чужеродных белков в клетках.

Существует три типа экспрессионных систем - бактериальные, сконструированные обычно на основе E.coli, дрожжевые и экспрессионные культуры клеток млекопитающих. Каждая из этих систем имеет свои преимущества и недостатки. Бактериальные системы наиболее удобны для клонирования, обладают высоким уровнем экспрессии (до 1-2 грамм белка на литр культуры) и их используют, обычно, для производства большого количества чистого белка, необходимого для получения антител или для фармацевтических целей. Удобны также эти системы для введения изменений в различные районы полипептидной цепи путем сайт-направленного мутагенеза в нуклеотидной последовательности чужеродной ДНК. Получение и исследование таких "мутантных" белков очень важно для оценки функциональной значимости различных участков белка.Уровень экспрессии чужеродных белков в дрожжевых клетках вдвое, а в клетках млекопитающих в десятки раз ниже, чем в бактериальных. Однако, в бактериальных клетках отсутствуют ферментативные системы, обеспечивающие процессинг эукариотических белков. Поэтому эукариотические системы удобнее использовать для изучения посттрансляционных модификаций белка - гликозилирования, то есть присоединения к полипептидной цепи углеводных остатков; скручивания белка с образованием третичной структуры, часто, за счет возникновения дисульфидных связей; и N-концевых модификаций, стабилизирующих структуру белка. В ДНК-экспрессионных системах может быть синтезировано достаточно много белка, чтобы получить его в кристаллической форме и исследовать пространственную структуру и функциональное назначение отдельных доменов(Хэймс, Хиггинс, 1987).Использование экспрессионных библиотек для изоляции кодирующих последовательностей гена рассматривалось ранее . После секвенирования кДНК можно, исходя из генетического кода, прогрозировать аминокислотный состав белка и произвести компьюторный поиск в банке данных гомологичных последовательностей в составе белков с уже известной структурой и функциями. Выявление родственных белков, близких по своему полипептидному составу, значительно ускоряет и облег чает дальнейший молекулярный анализ функционирования исследуемого белка в клетке. Аминокислотная последовательность белка позволяет прогнозировать его третичную структуру, идентифицировать домены, оценивать функциональную значимость целого белка и отдельных его компонентов. Не менее важным практическим следствием этих данных является также возможность получения антител к строго специфичным участкам белка. Для этого могут быть использованы два подхода - биохимический и молекулярно-генетический. В первом случае для иммунизации используют искусственно синтезированные полипептиды,которые пришивают к белковой молекуле-носителю (гаптену).Размеры таких полипептидов, обычно, не превышают 30 аминокислот - они не могут быть очень большими из-за высокой стоимости и трудоемкости синтеза длинных молекул. При втором подходе экзонные участки гена инсертируют в экспрессионный вектор в область, кодирующиую селектируемый белок. В результате экспрессии такой конструкции получают слитый белок, в котором наряду с аминокислотной последовательностью селектируемого маркера содержится определенный фрагмент исследуемого белка. Эту химерную молекулу и используют для иммунизации животных и получения моновалентных или моноклональных антител. При наличии антител могут быть применены различные иммунологические подхооды для анализа тканеспецифического и внутриклеточного распределения белка, исследования его модификаций, а также для получения нативного белка в препаративных количествах.

Cледующим шагом на пути анализа молекулярных механизмов регуляции экспрессии гена является идентификация тех нарушений в структуре, локализации и активности молекул мРНК и белка, которые возникают вследствие генетических мутаций. Мы уже упоминали об огромном значении культур мутантных клеток для подобных исследований. Однако, многие патологические процессы, протекающие в организме больного, не могут быть исследованы in vitro. С другой стороны, возможности получения необходимого количества клеток и тканей пациента и испы-тания in vivo различных схем лечения значительно ограничены.Поэтому для многих наследственных болезней эффективность изучения основ патогенеза существенным образом зависит от наличия адекватных биологических моделей. Способы конструирования таких моделей подробно изложены в Главе YIII.