b) кломифена цитрат — по 50-100 мг/сут. с 3-го или 5-го дня цикла в течение 5 дн. в зависимости от длительности менструального цикла. При достижении размеров доминантного фолликула диаметром 17-18 мм в/м вводят 10000 ЕД хориогонина в 22.00. Через 35-36 ч производят аспирацию ооцитов (ультразвуковая пункция, лапароскопия);

c) кломифена цитрат — по 100 мг/сут. с 3-го по 7-й день и по 3 ампулы хумегона на 6, 8, 10 дни цикла. При возникновении доминантного фолликула диаметром 18 мм и более и уровне эстрадиола (Е2) 300‑400 пг/мл на один растущий фолликул вводят в/м 1000 ЕД ХГ. Сочетанные методы обладают большей эффективностью из-за потенцирования действия друг другом.

Для стимуляции роста фолликулов чаще всего используют кломифен, менопаузный гонадотропин человека, хориогонадотропин, Фолликулостимулирующий гормон, а также их различные сочетания.

Забор яицеклеток

Существует несколько методов забора яицеклеток для оплодотворения . Ооциты могут быть получены при лапароскопии, минилапаротомии или путем аспирации фолликулов под контролем УЗИ.

Методика лапароскопии

Премедикация и общая анестезия проводятся также, как и при обычной лапароскопии.

В брюшную полость вводится газовая смесь, содержащая 5% CO, 5%O, 90%N .

Аспирацию предовуляторного фолликула производят длинной иглой (24 см), изогнутой под углом 45 с наружным диаметром1,3 мм и просветом в 1,1 мм. Игла проводится через канюлю, введенную в брюшную полость в точке, расположенной на середине между лонным сочленением и пупком по средней линии живота.

Для аспирации фолликула применяется пониженное давление. Точка пункции фолликула должна располагаться в неваскуляризованной области или примыкать к стромальным элементам яичника для того, чтобы предотвратить утечку фолликулярной жидкости из переполненного фолликула. Собранная фолликулярная жидкость может быть сразу исследована на содержание в ней яйцеклетки

Обработка яйцеклетки

Предовуляторная яйцеклетка человека может быть обнаружена невооруженным глазом по наличию в аспирате массивных и клейких хлопьев размером до 5 мм и более. Однако важно убедиться, что яйцеклетка действительно находится в этих хлопьях путем их просмотра в препарационном микроскопе.

Яйцеклетка 2 раза обмывается оплодотворяющей средой, которая удаляет большую часть фолликулярной жидкости. Затем она переносится в капле равновесной оплодотворяющей Среды под стерильное парафиновое масло. В качестве оплодотворяющей среды применяется раствор Тироде, содержащий пируват, альбумин, антибиотики.

Приготовление сперматозоидов

Для получения свежей спермы, мужа больной просят собрать свой эякулят в стерильный контейнер в отдельной комнате. Сперму с учетом ее разжижения при комнатной температуре разводят в 2 смывах оплодотворяющей среды. Удаление семенной плазмы производят следующим образом. Небольшое количество спермы разводят в 4-кратном объеме оплодотворяющей среды, затем суспензию сперматозоидов центрифугируют, удаляют надсадочную жидкость, ресуспензируют комочек сперматозоидов и повторяют эту процедуру. Полученный таким образом комочек сперматозоидов вновь ресуспендируют, определяют их концентрацию и подвижность и доводят эти параметры до значений, которые считаются стандартными для процедуры оплодотворения яйцеклетки.

Оплодотворение

Затем сперматозоиды переносят в специальный термостат, где уже находятся яйцеклетки. При осеменении на 1 яйцеклетку добавляют 200000-300000 сперматозоидов.

Процесс культивирования происходит в специальной среде с абсолютной влажностью, при температуре 37оС в растворе с рН, равным приблизительно 7,6, в атмосфере, содержащей 5% СО2, 5% О2 и 90% N2. Яйцеклетку оставляют в суспензии сперматозоидов на 6‑18 ч.

Следующие морфологические особенности яйцеклетки, большинство которых может быть выявлено с помощью микроскопа, могут определить признаки произошедшего оплодотворения:

1. Выталкивание второго полярного тельца в желточное пространство.

2. Цитоплазма яйцеклетки сжимается, отступая от оболочки.

3. В ранней стадии оплодотворения в цитоплазме яйцеклетки может наблюдаться головка, срединный сегмент и хвост сперматозоида. Эти признаки могут отмечаться только при сильном увеличении, используя фазово-контрастную методику.

4. В более поздние стадии (около 12­­‑18 ч после инсеминации) в цитоплазме могут быть мужские и женские проядра.

Деление зиготы

После завершения периода инсеменации яйцеклетку переносят в равновесную каплю среды по парафиновое масло. Среда состоит из свежеприготовленного раствора Ham F10 с добавлением 15% сыворотки крови больной. Растущий эмбрион человека культивируется при температуре 37оС в атмосфере, содержащей 5% СО2, 5% О2 и 90% в среде с рН, равным 7,3.

О нормальном развитии эмбриона в культуре свидетельствует появление делящихся клеток приблизительно одинакового размера и формы, которые равномерно заполняют большую часть пространства в пределах блестящей оболочки. Деление клеток должно быть нарастающим и наблюдаться во время четко определенного времени. Так, эмбрион должен содержать 2 клетки через 35-46 часов, 4 клетки через 51-63 часа, 8 клеток через 68-86 часов после инсеминации, а стадия 16 клеток должна быть достигнута в пределах 84-112 часов после.

Если клетки развивающегося эмбриона имеют неправильную форму или отходят от блестящей оболочки, или же скорость деления клеток существенно отличается от описанной выше, то развитие эмбриона считается патологическим и он непригоден для переноса в полость матки.

Перенос эмбриона

Так как в большинстве случаев эмбрион переносится в полость матки на стадии 8 или 16 клеток, то это означает, что эмбрион человека перед имплантацией должен содержаться в культуре в течение 3‑4 суток.

Эмбрион в 0,05 мл культуральной среды осторожно засасывается в стерильный катетер диаметром 1,4 мм. Затем катетер проводится через цервикальный канал в полость матки, где в области дна эмбрион высвобождается из катетера. С целью облегчения проведения этой процедуры катетер следует разместить по длине для контроля положения его конца в полости матки. Помимо этого, следует очень аккуратно манипулировать шейкой матки во избежание сокращения мышц матки.

Контроль подтверждения беременности

Для контроля ранних сроков развивающейся беременности проводят динамическое определение -субъединицы хорионического гонадотропина, которое помогает определить беременность с 7-9-го дня после ТЭ. При наступлении беременности за женщинами ведется постоянное наблюдение методами, принятыми для ведения беременности и родов женщин с отягощенным акушерским анамнезом.

Должно производиться серийное ультразвуковое обследование плода. На 1‑7‑й неделе беременности определяется положение амниона и сердечная деятельность плода. После этого контроль должен производиться на 20‑й,28-й неделе и далее с целью определения степени развития плода. На основании полученной информации можно наблюдать характеристики роста плода на протяжении беременности и выявить определенную патологию развития скелета. Пункцию амниона можно производить приблизительно на 16‑й неделе беременности. Таким образом, может быть определен кариотип и уровень a-фетопротеинов, определяющий наличие дефектов развития нервной трубки плода.