3. Кровозаменители на основе гемоглобина.

Попытки применения растворов гемоглобина в клинических целях предпринимались уже в начале века и были возобновлены в 30 - 40 гг. Эксперименты по введению растворов гемоглобина в различных дозах, концентрациях и при разных степенях кровопотери показали способность последних поддерживать жизнь животных, обеспечивая транспорт кислорода. Однако эти работы выявили также выраженную нефротоксичность этих препаратов.

Одна из основных причин нефротоксичности установлена в 1967 г. после применения растворов гемоглобина, очищенных от стромальных компонентов. Они не повреждали почки. Сделан вывод в том же году, что повреждение почек вызывается стромальной фракцией эритроцитов [3].

Уже рассмотренные выше патофизиологические основы сниженной отдачи кислорода тканям растворами внеэритроцитарного гемоглобина связаны с потерей в процессе выделения очищенного раствора гемоглобина 2,3-дифосфоглицерата, природного специфического регулятора обратимой оксигенации, находящийся внутри эритроцита. Ученые довольно продолжительное время решали эту проблему и в результате пришли к выводу о замене этого регулятора каким-либо другим.

Впервые в качестве необратимого присоединения был описан пиридоксаль-5'-фосфат - коферментная форма витамина В6. Альтернативным путем снижения сродства гемоглобина к кислороду является использование кетокислот, которые также могут необратимо присоединяться к гемоглобину. Это позволило приблизить транспортные характеристики (по кислороду) внеэритроцитарного гемоглобина к физиологическим значениям [3, 14].

Выше уже говорилось о том, что раствор гемоглобина при введении его в кровоток резко увеличивает онкотическое давление, тем самым изменяя гемодинамику. Однако, согласно последним данным, полимеризованный гемоглобин с молекулярной массой 600 000 при концентрации 6г/100 мл обнаруживает сравнительно небольшое онкотическое давление крови порядка 20 мм. рт. ст., что близко к онкотическому давлению крови. Но при концентрации 12г/100мл раствор такого гемоглобина имел онкотическое давление 40 мм. рт. ст. Но в Америке (A.G. Greenburg) создан гемоглобин с молекулярной массой 1млн., который даже в концентрации 14г/100 мл обусловливал онкотическое давление 20 мм рт. ст. При такой концентрации раствор имеет кислородную емкость, равную таковой для цельной крови.

Известно, что с помощью пиридоксальфосфата Р50 полимеризованного гемоглобина онкотическое давление может быть повышено с 15 - 20 до 28 - 30 мм рт. ст. и выше. При специальных мерах предосторожности такие препараты могут сохранять свои кислородпереносящие свойства в течение 2 -12 месяцев при образовании метгемоглобина не более 0,6% в месяц.

В современной литературе по этой проблеме встречаются мнения о том, что полимеризованный гемоглобин с большой и очень большой молекулярной массой является первым реальным кандидатом на преклинические и клинические испытания. Но возникают проблемы, без решения которых нельзя приступать к клиническим испытаниям.

Одна из таких проблем - неясность судьбы этих гигантских молекул в организме.

Предполагают, что они разрушаются в ретикулоэндотелиальной системе опсонинами плазмы и макрофагами. Это, по мнению Greenburg, "отвлекает" иммунологические механизмы от выполнения прямых задач и ослабляет иммунологическую защиту. Кроме того, при массивных инфузиях гигантские молекулы оказывают токсическое действие на ткани как самой молекулой, так и образующимися метгемоглобином и димерами гемоглобина. Внеэритроцитарный гемоглобин слишком быстро выводится из кровеносного русла [6].

В настоящее время обсуждаются следующие пути решения этой проблемы: моделирование эритроцитов путем микрокапсулирования растворов гемоглобина; химическая модификация гемоглобина с получением полигемоглобина и его конъюгатов с биополимерами; внутримолекулярная модификация гемоглобина, препятствующая его диссоциации на димеры.

Важным направлением в современном развитии проблемы создания "искусственной крови" является создание неких микротелец или микрокапсул, содержащих гемоглобин. Тяжелые физиологические последствия разрушения эритроцитов известны давно, и еще в 1971 г. были сделаны первые попытки создания искусственных эритроцитов в виде твердых нейлоновых капсул с гемоглобином (T. Chang). Но первые опыты были неудачны, а перспективную идею вывели из небытия совсем недавно M.C. Farmer и B.P. Garber, создав методику получения липосом. При осуществлении микрокапсулирования растворов гемоглобина для создания искусственных мембран используются, кроме липидов, и синтетические полимеры, некоторые полимеризованные белки. Толщина получаемых мембран сравнима с толщиной мембран эритроцитов.

Основная проблема - короткий период циркуляции микрокапсул в кровеносном русле. А в 1989 г. Е. Tsuchida с помощью новейших методов создал структурные единицы в виде телец овальной формы диаметром в среднем 0,1 мкм. Каждая частица состояла из 500 - 2300 гемов гемоглобина, заключенных в двухслойную фосфолипидную мембрану. Двухслойная мембрана липосом обладала повышенной механической прочностью и стабильностью. Последняя значительно увеличивалась при внедрении особым способом в состав мембран токоферола (витамина Е), являющимся сильным антиоксидантом. Он предохранял мембрану от разрушительного действия оксидантов и удлинял срок сохранения ее структурной целостности. При замещении крови на 80 - 90% все животные выживали. Из этого следует, что по сути дела речь идет о создании аналогов функционирующей клетки.

Казалось бы, что эта упрощенная модель эритроцита, судя по экспериментальным данным, может успешно функционировать в человеческом организме, и пора бы переходить на клинические испытания. Но в этих липосомах гемолипидный комплекс был способен осуществить лишь около 1 тысячи циклов "оксигенация - дезоксигенация". Это означает 6 - 8 часов "работы". Эритроцитарный же гемоглобин функционирует в течение 90 - 120 дней (по другим данным 40 дней) и способен осуществить 400 тысяч циклов.

Кроме этого, автор в своей работе засекретил методику изготовления микротелец, но, учитывая строение микротелец и насколько сложна их конструкция, можно предположить, что методика очень дорогая и трудоемкая, и она не сможет удовлетворить потребности, например при массовом травматизме. К тому же возникает вопрос о механизмах разрушения и дезактивации таких очень сложных структур и продуктов их разрушения. Отмечается также внедрение искусственных липосом в элементы ретикулоэндотелиальной системы клетки и нарушении ее функции [3, 6, 22].

Самой важной проблемой создания "искусственной крови" данного направления остается сохранение гемоглобином нативных свойств в течении длительного промежутка времени. В норме непрерывно происходящее разрушение этой сложной молекулы в эритроците купируется с помощью биологической работы ресинтеза, которая протекает с использованием энергии за счет гидролиза АТФ. Возможность искусственного получения таких мембран была показано еще 20 лет назад. Имеется принципиальная возможность создания таких мембран и для гемоглобинсодержащих липосом, но такая перспектива выглядит довольно отдаленной [6, 12].