Построение диагностикумов для серодиагностики бактериальных и вирусных заболеваний, выявление и идентификация с их помощью антител в биологических и клинических образцах проводится аналогичным образом. Обычно приготовляется так называемый иммуносорбент - антиген, иммобилизованный на твердом носителе (либо за счет его прямой сорбции на твердую матрицу, либо за счет ковалентной «пришивки» к этой матрице, либо за счет иммуносорбции на иммобилизованные первичные антитела). Затем исследуемая сыворотка, содержащая или не содержащая выявляемые антитела, контактирует с иммуносорбентом. Степень адсорбции специфических к иммобилизованному антигену иммуноглобулинов обычно определяется с помощью антивидовых конъюгатов. Использование антивидовых антител к различным классам иммуноглобулинов позволяет выявить в исследуемом образце не только специфические к использованному антигену антитела, но и провести их изотиповой анализ.

Конкретные методики диагностики и серодиагностики заболеваний бактериальной и вирусной природы, использующие иммуноферментные подходы, отличаются многими параметрами, в частности, типом и формой адсорбента, на котором иммобилизуется иммунный комплекс. В качестве твердофазного носителя может использоваться целый ряд полимеров: полиметилметакрилат., и нейлон, тефлон, полипропилен и др. Однако наиболее часто в качестве адсорбента в настоящее время применяется полистирол и поливинилхлорид. Для удобства проведения анализа эти адсорбенты производятся в виде многолуночных плашек, шариков или палочек. Использование плашек, изготовленных из оптически прозрачного полистирола или поливинилхлорида позволяет проводить все операции ТФИФА, включая конечное фотометрирование хромофорной субстратной смеси. Не менее существенным преимуществом полистироловых плашек перед другими формами адсорбента является возможность автоматизации практически всех операций анализа, включая трудоемкие этапы промывки лунок и внесения в них однотипных реагентов.

Следует отметить, что использование полистироловых плашек для целей ТФИФА имеет и некоторые недостатки - высокие требования к чистоте полимерного материала и точности изготовления плашек и нерентабельность их использования для одиночных анализов.

Большое внимание при постановке ТФИФА обычно уделяется правильному выбору фермент-субстратной системы. В современных диагностических иммуноферментных тест-системах используется большое число разнообразных ферментов и субстратов. Выбор той или иной фермент-субстратной пары для использования в конкретной тест-системе на основе ТФИФА диктуется несколькими соображениями. Во-первых, обращается внимание на стабильность в процессе анализа и хранения как крайне чувствительного к структурным внутримолекулярным перестройкам конъюгата, так и во многих случаях светочувствительного хромофорного или флуорохромного субстрата. Во-вторых, это отсутствие используемого в диагностикуме фермента или субстрата (свободного или связанного) в биологических или клинических образцах, которые предстоит анализировать. В-третьих, наличие соответствующей регистрирующей аппаратуры (спектрофотометра или спектрофлуориметра). И, наконец, в-четвертых, выбор той или иной фермент-субстратной пары диктуется естественным желанием экспериментатора или клинициста иметь в руках систему, обладающую максимальной специфичностью и чувствительностью.

Таблица: Фермент-субстратные системы, наиболее часто используемые в твердофазном ИФА

*Для фотометрических измерений указаны только наиболее часто используемые длины волн наблюдения; для флюорометрических измерений - длины волн флюоресценции и возбуждения (в скобках).

Специфичность диагностической системы не зависит от выбора фермент-субстратной пары и определяется в основном чистотой и гомогенностью используемых при конструировании диагностикума препаратов антигенов и антител. Использование в ТФИФА не гетерогенных антиген-содержащих препаратов и даже не очищенных бактерий и вирусов, а индивидуальных бактериальных и вирусных белков - вот единственный, хотя и трудоемкий путь повышения специфичности диагностических систем. То же можно сказать и о препаратах, используемых в ТФИФА иммуноглобулинов, - желательно использовать не цельные сыворотки и даже не суммарные гаммаглобулиновые фракции этих сывороток, а аффинноочищенные или моноклональные антитела.

Особой популярностью в настоящее время у нас в стране пользуются иммуноферментные конъюгаты на основе пероксидазы хрена. Это, вероятно, связано с доступностью сырья для выделения этого фермента, относительно легкостью очистки, достаточно высокой стабильностью , и большим числом хромофорных и флуорохромных субстратов Тем не менее следует подчеркнуть, что два других достаточно часто используемых в ТФИФА фермента - щелочная фосфатаза и b-галактозидаза - в некоторых случаях имеют целый ряд преимуществ перед пероксидазой. Это, во-первых, высокая стабильность, растворимость и нетоксичность субстратов, а, во-вторых, возможность использования относительно недорогих флуорохромных субстратов, применение которых резко повышает чувствительность анализа.

Определенное значение для реализации максимальной чувствительности ТФИФА имеет правильный выбор субстрата. Наряду с естественным желанием использовать субстраты с высокой удельной хромофорной активностью (высокий коэффициент молярной экстинкции окрашенного конечного продукта) необходимо принимать во внимание такие важные факторы, как рвстворимость субстрата и продуктов его ферментативной модификации в условиях проведения анализа и стабильность этих субстратов при хранении и в процессе эксперимента.