К биохимическим методам примыкают имеющие самостоятельное значение для расшифровки природы мутаций непосредственно в ДНК молекулярно-гентические методы. Традиционно их применение возможно после выявления дефекта в соответствующем генном продукте, однако пока оно реально для немногих случаев патологии, например, для мутаций глобиновых генов.

Плодотворность биохимических методов исследования в значительной мере бусловлено тем, что биохимический анализ биологических жидкостей дополнен анализом клеток организма. Генетический биохимический анализ на клетках оказался решающим в переходе к биохимической диагностике с анализом метаболитов на исследование непосредственно ферментов и структурных белков, в частности клеточных рецепторов.

Это привело к открытию первичных дефектов белковых молекул и многих наследственных болезней. Близки биохимическим методам по своим возможностям иммунологические методы. На методах оценки уровня сывороточных иммуноглобулинов разных классов, а также состояния клеточного иммунитета основана диагностика и углублённое изучение генетических форм различных наследственных иммундефицитных состояний. Видное место в арсенале этих методов занимают классические серологические реакции с эритроцитами или лейкоцитами для определения состояния поверхностных антигенов. В последние годы всё более широкое применение получают радиоиммунохимические методы определения дефекта гормонов и некоторых других биологически активных веществ.

Все указанные методы применяются для выявления биохимических дефектов и молекулярной природы мутаций с популяционно-географическим подходом. Значение этого подхода состоит в том, что редкие дефекты и мутации могут возникать преимущественно в каких-то определённых географических регионах в связи со специфическими условиями окружаюшей человека среды. Достатачно вспомнить о преимущественном распространении разных геноглобинопатий, особенно в зонах распространения малярии. Изолированные популяции с большим количеством кровных браков нередко служили источником открытия новых мутаций в связи с более частым выщеплением гомозигот при рецессивном состоянии. Популяционно-географический подход помогает также при больших выборках больных скорее дифференцироватьфенотипически сходные, но генетически различные мутации.

БОЛЕЗНИ С ВЫЯСНЕННЫМ

ПЕРВИЧНЫМ БИОХИМИЧЕСКИМ ДЕФЕКТОМ.

По существующим биохимическим оценкам, основанным на изучении метаболических превращений известных продуктов обмена, в организме человека должно функционировать не менее 10000 различных ферментов. К настоящему времени наследственные дефекты найдены приблизительно для 140-150 ферментов, то есть для 1-2% от числа теоретически возможных. Анализ состава ферментов, для которых известны генетические дефекты, позволяет охарактеризовать обнаруженные генетические дефекты и наметить перспективы дальнейших их поисков.

Обмен любых веществ в организме складывается из двух сопряжённых процессов – ферментального расщепления молекул на более простые соединения (катаболизма) и ферментативного синтеза сложных молекул из более простых предшественников (анаболизма). Оказывается, что подавляющее число дефектов касается ферментов, которые осуществляют катаболизм различных биологических субстратов: аминокислот, сахаров, а также более сложных полимеров (гликогена). Сравнительно редки мутантные ферменты, осуществляющие анаболизм биологических субстратов.

Обнаружены единичные мутации, связанные с ферментами репарации ДНК, ферментами энергетического обмена циклотрикарбоновых кислот, системы цитохромов. Не имеется сведений о мутациях генов, которые кодируют ферменты ключевых биосинтетических процессов в клетке, связанных с клеточной репродукцией (синтез ДНК, белков) и делением клеток. Другая особенность известных энзимопатий заключается в том, что их можно диагностировать по состоянию доступных биологических жидкостей (кровь, моча, желудочный сок) или клеток (клетки крови, кожи, костного мозга). Поэтому можно предполагать, что дальнейший прогресс в обнаружении новых наследственных болезней обмена веществ, обусловленных дефектами ферментов, будет связан с доступностью для анализа, особенно для культивирования вне организма клеток более специализированных тканей. Можно предполагать, что этим путём будут открыты как новые типы ферментов, так и их генетические дефекты. По-видимому, дефекты большинства ферментов, известных и ещё неоткрытых, которые участвуют в жизненно важных для клетки функциях, являются летальными, и соответствующие гаметы или эмбрионы погибают.

Для открытых наследственных энзимопатий характерно несколько общих особенностей, которые учитываются при клинической диагностике, расшифровке биохимического дефекта и выделении новых генетических форм.

1.Мутации соответствующих генов влияют на структурно-функциональное состояние фермента различными путями, что зависит от типа мутации и её локализации в гене.

2.Мутация может затрагивать биосинтез фермента, приводя к снижению его интенсивности.

3.Часто мутации касаются активности фермента, не отражаясь на абсолютном его содержании. Степень снижения активности может быть разной при различных энзимопатиях. Разработанные в последнее время чуствительные методы позволяют в большинстве случаев обнаружить даже небольшую остаточную активность ферментов. Снижение активности или её отсутствие может быть связано не с изменением самого фермента, а с мутационным дефектом кофактора, если фермент активируется кофактором.

4.У гетерозиготных носителей мутантного гена присутствие нормального аллея обеспечивает сохранение примерно 50% активности фермента по сравнению с её нормальным уровнем. Поэтому наследственные дефекты ферментов клинически проявляются у гомозигот, патологические состояния наследуются, следовательно, по аутосомно-рецессивному или сцепленному с Х-хромосомой рецессивному типу. Недостаточная активность фермента у гетерозиготного носителя может быть обнаружена путём непосредственного определения активности фермента в клетках по изменённому количеству метаболита после нагрузки организма соответствующим субстратом.

5.Большинств ферментов существует в виде двух или более изоферментов. Мутации могут затрагивать состояние одного из них, и если этот изофермент имеет тканеспецифическое распределение, дефект на клеточном уровне проявится лишь в тех клетках, которые содержат изофермент.

6.Разные мутации (независимые случаи заболевания) по данному ферменту, происходящие в разных кодонах гена, могут затрагивать разные физико-химические свойства фермента, отражаясь на его термоустойчивости, кинетических параметрах, электрофоретической подвижности и других свойствах.

Физико-химическая характеристика фермента является основой выделения генетических вариантов мутации, установления генетической гетерогенности энзимопатии.

7.Для данной энзимопатии степень снижения активности фермента у разных больных может коррелировать с тяжестью клинических проявлений, поэтому по каждой из нозологических форм всегда имеется спектр различающихся по тяжести проявлений. Проявление каждой энзимопатии зависит от специфической функции фермента, характера дополнительных нарушений обмена, обусловленных основным ферментным дефектом.